Protože jejich nové elektronické konfigurace, fluorochromes mají jedinečné a charakteristické spektrum absorpce (obvykle podobné excitace) a emise. Tyto absorpční a emisní spektra ukazují relativní Intenzita fluorescence, s relativní intenzitou klasicky vyneseny na svislé ose proti vlnové délky na vodorovné ose. Pro daný fluorochrom výrobci udávají vlnovou délku pro vrchol intenzity buzení osvětlení a vlnovou délku pro vrchol intenzity emisí fluorescence. Je důležité pochopit původ grafů a křivek zobrazujících excitační a emisní spektra pro daný fluorochrom.

aby bylo možné určit emisní spektrum konkrétního fluorochrome, při vlnové délce maximální absorpce (obvykle stejné jako excitační maximum) je určena a fluorochrome je nadšený, že na této vlnové délce. Absorpční spektrum typického fluorochromu je znázorněno na obrázku 1(a), kde je relativní intenzita absorpce zakreslena proti měřené vlnové délce. Monochromátor (zařízení, které umožňuje průchod úzkých pásem světelných vlnových délek) se pak používá ke skenování intenzity fluorescenční emise v celé řadě emisních vlnových délek. Relativní intenzita fluorescence se měří na různých vlnových délkách pro vykreslení emisního spektra, jak je znázorněno na obrázku 1(b). Excitační spektrum dané fluorochrome je určena obdobným způsobem sledováním fluorescenční emise při vlnové délce maximální intenzity, zatímco fluorophore je nadšený, že prostřednictvím skupiny po sobě jdoucích vlnové délky. Zvolí se emisní maximum a do detektoru smí projít pouze emisní světlo při této vlnové délce. Excitace je indukována (obvykle pomocí monochromátoru)při různých excitačních vlnových délkách a intenzita emitované fluorescence je měřena jako funkce vlnové délky. Výsledkem je graf, nebo křivky (znázorněno na Obrázku 1(a)), který znázorňuje relativní fluorescenční intenzita produkován excitace přes spektrum excitačních vlnových délek.

Fluorescenční Filtr Spectra

Prozkoumat překrytí oblastí fluorescence excitace, emise, a dvoubarevný filtr spektrální profily a jak změny v přenosové charakteristiky určete šířku pásma vlnových délek prošel různé kombinace filtrů.

z typické budicí a emisní sady křivek nebo spekter lze provést několik pozorování. Obvykle dochází k překrývání mezi koncem vyšší vlnové délky excitačního spektra a koncem nižší vlnové délky emisního spektra. Toto překrývání excitačních a emisních intenzit a vlnových délek (znázorněno na Obrázku 1(c)), musí být odstraněny, fluorescenční mikroskopie, pomocí vhodného výběru pro buzení filtru, dvoubarevný beamsplitter (fluorescence v odraženém světle), a bariéra nebo emisní filtr. V opačném případě mnohem jasnější budicí světlo přemůže slabší emitované fluorescenční světlo a výrazně snižuje kontrast vzorku.

Když elektrony přejít z excitovaného stavu do základního stavu (viz níže oddíl nazvaný Molekulární Vysvětlení), je ztrátou vibrační energie. V důsledku toho je emisní spektrum posunuto na delší vlnové délky než excitační spektrum (vlnová délka se mění nepřímo na energii záření). Tento jev je známý jako Stokesův zákon nebo Stokesův posun. Čím větší je Stokesův posun, tím snazší je oddělit budicí světlo od emisního světla. Maximální intenzita emisí je obvykle nižší než excitační vrchol a emisní křivka je často zrcadlovým obrazem excitační křivky, ale posunutá na delší vlnové délky. V zájmu dosažení maximální fluorescence intenzita, fluorochrome je obvykle nadšený při vlnové délky na vrchol excitace křivky a emisí detekce je vybrán na vrchol vlnové délky (nebo jiné vybrané vlnové délky od pozorovatele) emisní křivky. Výběr excitačních vlnových délek a emisních vlnových délek je řízen vhodnými filtry. Při určování spektrální odezvy optického systému jsou nutné technické opravy, aby se zohlednily takové faktory, jako je přenos skla a proměnné citlivosti detektoru pro různé vlnové délky.

typický spektrální diagram absorpce a emisí fluorochromu je znázorněn na obrázku 2. Všimněte si, že křivky intenzity fluorescence pro absorpci (obvykle podobné excitační křivce pro čisté sloučeniny) a emise pro tento typický fluorochrom mají poněkud podobný tvar. Posun vlnové délky mezi excitací a emisemi je znám od poloviny devatenáctého století(Stokesův zákon). Všimněte si také, že excitační a emisní křivky se poněkud překrývají na horním konci excitace a dolních vlnových délkách emisní křivky.

Fluorescenční Filtrační Kostky

Zjistit, jak změny v pásmovým oblasti vlnových délek excitace a bariérový filtry umožňují určité pásmo vlnových délek k osvětlení vzorku, a pak projdou k detektoru, zatímco všechny ostatní jsou vyloučeny.

oddělení excitačních a emisních vlnových délek je dosaženo správným výběrem filtrů pro blokování nebo průchod specifických vlnových délek spektra, jak je znázorněno na obrázku 3. Konstrukce fluorescenčních iluminátorů je založena na řízení budicího světla a emisního světla snadno vyměnitelnými vložkami filtru do světelné dráhy na cestě k vzorku a poté vycházející ze vzorku. To je důležité, s ohledem na nízké emisní intenzity, že světelný zdroj vybrán pro buzení být dostatečný jas tak, že relativně slabé emise světla může být maximalizována, a to fluorochromes uspokojivé absorpce a výnos být vybrán.

účinnost, se kterou fluorochrom absorbuje excitační světlo, se nazývá koeficient extinkce. Čím větší je extinkční koeficient, tím větší je možnost absorpce světla v dané vlnové oblasti (předpokladem pro následné fluorescenční emise). Výnos vyzařovaného světla se označuje jako kvantový výtěžek je poměr počtu kvant („pakety“ energie) emitovaného v porovnání k počtu kvant vstřebává (obvykle výnos je mezi 0.1 a 0.9). Kvantové výtěžky nižší než 1, jsou výsledkem ztráty energie prostřednictvím non-radiační drah (jako je teplo nebo fotochemické reakce), spíše než re-radiační cesta fluorescence. Níže v tabulce 1 jsou uvedeny fluorescenční kvantové výtěžky pro skupinu vybraných fluorochromů. Všimněte si, že některé kvantové výtěžky se zdají triviální (benzen), zatímco jiné jsou velmi účinné (Fluorescein a Rhodamin-B).

Fluorochrome Fluorescenční Kvantové Výtěžky
Sloučenina Rozpouštědlo, Excitace
Vlnová délka,
(nm)
Emisních
Vlnová délka,
(nm)
Kvantový Výtěžek
Akridin Oranžová Ethanol 493 535 0.46
Benzen Ethanol 248 300-350 0.04
Chlorofyl- Ethanol 440 685 0.23
Eosin Voda 521 544 0.16
Fluorescein Voda 437 515 0.92
Rhodamine-B Ethanol 555 627 0.97
Tabulka 1

Extinkční koeficient, kvantový výtěžek, střední svítivost zdroje světla a fluorescence lifetime jsou všechny důležité faktory, které přispívají k intenzitě a užitečnost fluorescenční emise. Navíc lokalizované prostředí obklopující fluorochrom hraje prvořadou roli při určování charakteristik fluorescenční emise. Proměnné, jako je viskozita rozpouštědla, iontové koncentrace, pH a hydrofobita v prostředí, mohou mít hluboké účinky jak na intenzitu fluorescence, tak na životnost excitovaného stavu.

Molekulární Vysvětlení Fluorescence

Fluorescenční aktivita je někdy schematicky znázorněno, jak je znázorněno na Obrázku 4(a) (tzv. Jablonski energie diagram). Před excitací je elektronická konfigurace molekuly popsána jako v základním stavu. Na absorbuje foton na excitační světlo, obvykle krátkých vlnových délkách, elektrony může být zvýšena na vyšší energetické a vibrační excitovaného stavu, proces, který může trvat jen quadrillionth sekundy (časové období, obyčejně odkazoval se na jako femtosecond, 10E-15 sekund).

Ve fluorescence, v intervalu přibližně jedné biliontině sekundy (pikosekundový nebo 10E-12 sekund), excitované elektrony se mohou ztratit některé vibrační energie do okolního prostředí a návrat k tomu, co se nazývá nejnižší excitovaného singletového stavu. Z nejnižšího excitovaného singletového stavu jsou pak elektrony schopny „relaxovat“ zpět do základního stavu se současnou emisí fluorescenčního světla, jak je znázorněno na obrázku 4(a). Vyzařované světlo má vždy delší vlnovou délku než excitační světlo (Stokesův zákon) a pokračuje tak dlouho, dokud excitační osvětlení koupe fluorescenční vzorek. Pokud je vzrušující záření zastaveno, fluorescence přestane.

Jablonski energetický Diagram

prozkoumejte, jak elektron absorbuje energii a překračuje vyšší energetický stav podle Jablonského energetického diagramu. Jakmile elektron je v excitovaném stavu, to se pomalu uvolňuje přes vibrační efekty a může pak klesnout zpět na zem, stát vyzařováním fotonu (fluorescence).

Občas nadšený, elektrony, místo toho, relaxační nejnižšího singletového stavu prostřednictvím vibrační interakce, aby zakázaný přechod do vyšla trojice státu, a pak na zem, státu, v procesu, kde emise záření může být značně zpožděné-až na několik sekund, nebo více. Tento jev je charakteristický pro fosforescenci, jak je znázorněno na obrázku 4(b). V některých případech, excitované elektrony mohou přejít z trojice stavu zpět na nejnižší excitovaného singletového stavu, a pak se vrátit na zem, státu, následně emituje fluorescenční světlo. Tato akce trvá o něco déle (asi mikrosekundu nebo dvě) než obvyklá fluorescence a nazývá se zpožděná fluorescence (obrázek 4 (c)). Za jiných okolností (například, foto nebo přítomnost solí těžkých kovů a dalších chemikálií), vyzařované světlo může být výrazně snížena nebo zastavena úplně, jak je uvedeno níže.

Blednutí nebo Foto

Existují specifické podmínky, které mohou mít vliv na re-záření světla do excitovaného fluorophore, a tedy snížení intenzity fluorescence. Toto snížení intenzity emisí se obecně nazývá vyblednutí nebo fotobleaching. Někteří autoři dále rozdělují vyblednutí na kalení a bělení. Bělení je nevratný rozklad fluorescenčních molekul kvůli intenzitě světla v přítomnosti molekulárního kyslíku. Kalení také vede ke snížené intenzitě fluorescence a často je způsobeno oxidačními činidly nebo přítomností solí těžkých kovů nebo halogenových sloučenin.

Často, kalení výsledky z převodu energie na jiný akceptor molekuly fyzicky blízko nadšený fluorophores, což je jev známý jako rezonanční přenos energie. Tento konkrétní jev se stal základem pro novější techniku měření vzdáleností hluboko pod bočním rozlišením světelného mikroskopu.

výskyt bělení vedl k technice známé jako FRAP nebo fluorescenční zotavení po fotobleachingu. FRAP je založen na bělení krátkými laserovými výboji a následném pozorování obnovy fluorescence způsobené difúzí fluoroforů do bělené oblasti.

Vlastnosti Populární Antifade Činidla
Antifade Reagent
p-fenylen-
diamin
nejvíce účinné činidlo pro FITC. Také účinný pro Rhodamin. Měl by být upraven na 0, 1% p-fenylendiamin v glycerolu / PBS pro použití. Činidlo při vystavení světlu zčerná, takže by mělo být skladováno na tmavém místě. Kontakt s kůží je velmi nebezpečný.
DABCO
(1,4-diazabi-
cyklo-2,2,2-
oktan)
vysoce účinný pro FITC. I když je jeho účinek o něco nižší než p-fenylendiamin, je odolnější vůči světlu a má vyšší úroveň bezpečnosti.
n-propylgallát nejúčinnější činidlo pro Rhodamin, také účinné pro FITC. Měl by být upraven na 1% propylgalátu v glycerolu/PBS pro použití.
2-merkapto-
ethylamine
Použít k pozorování chromozomů a DNA vzorky barveny propidium jodid, akridin oranžová, nebo Chromomysin A3. By měla být upravena na 0,1 mM 2-mercaptotheylamine v Tris-EDTA
Tabulka 2

snížit míru vyblednutí v některé vzorky, to může být vhodné použít neutrální filtr do světelné dráhy před osvětlení dosáhne excitační filtr, čímž se snižuje excitační intenzity světla. V jiných případech mohou být vybledlé účinky sníženy změnou pH montážního média nebo použitím prostředků proti bělení(několik důležitějších látek je uvedeno v tabulce 2). U digitálního zobrazování, fotomikrografie nebo jednoduše vizuálního pozorování může rychlá změna zorného pole také zabránit vyblednutí.

Přispívající Autoři

Mortimer Abramowitz – Olympus America, Inc., Dvě Jednotky Firemního Centra., Melville, New York, 11747.

Michael W. Davidson-National High Magnetic Field Laboratory, 1800 East Paul Dirac Dr., Florida State University, Tallahassee, Florida, 32310.

Napsat komentář

Vaše e-mailová adresa nebude zveřejněna.