på grund af deres nye elektroniske konfigurationer har fluorochromer unikke og karakteristiske spektre til absorption (normalt svarende til ophidselse) og emission. Disse absorptions-og emissionsspektre viser relativ intensitet af fluorescens, med den relative intensitet klassisk afbildet på den lodrette akse versus bølgelængde på den vandrette akse. For et givet fluorokrom angiver fabrikanterne bølgelængden for toppen af belysningsekspitteringsintensiteten og bølgelængden for toppen af fluorescensemissionsintensiteten. Det er vigtigt at forstå oprindelsen af graferne og kurverne, der viser eksitations-og emissionsspektre for et givet fluorokrom.

for at bestemme emissionsspektret for et bestemt fluorokrom bestemmes bølgelængden af maksimal absorption (normalt den samme som eksitationsmaksimumet), og fluorokromet ophidses ved den bølgelængde. Absorptionsspektret for et typisk fluorokrom er illustreret i Figur 1(A), hvor den relative absorptionsintensitet er afbildet mod den målte bølgelængde. En monokromator (en enhed, der tillader smalle bånd af lysbølgelængder at passere) bruges derefter til at scanne fluorescensemissionsintensiteten over hele serien af emissionsbølgelængder. Fluorescensens relative intensitet måles ved de forskellige bølgelængder for at plotte emissionsspektret, som illustreret i Figur 1(b). Eksitationsspektret for et givet fluorokrom bestemmes på lignende måde ved overvågning af fluorescensemission ved bølgelængden med maksimal intensitet, mens fluoroforen ophidses gennem en gruppe på hinanden følgende bølgelængder. Emissionsmaksimumet vælges, og kun emissionslys ved den bølgelængde må passere til detektoren. Eksitation induceres (normalt ved hjælp af en monokromator) ved forskellige eksitationsbølgelængder, og intensiteten af den udsendte fluorescens måles som en funktion af bølgelængden. Resultatet er en graf eller kurve (illustreret i Figur 1(A)), som viser den relative fluorescensintensitet produceret ved ophidselse over spektret af eksitationsbølgelængder.

Fluorescensfilterspektre

Udforsk overlapningsregionerne for fluorescensekspression, emission og dikromatisk filterspektralprofiler, og hvordan ændringer i transmissionskarakteristika bestemmer båndbredden af bølgelængder, der passeres gennem forskellige filterkombinationer.

flere observationer kan foretages fra et typisk eksitations-og emissionssæt af kurver eller spektre. Der er normalt en overlapning mellem den højere bølgelængdeende af eksitationsspektret og den nedre bølgelængdeende af emissionsspektret. Denne overlapning af eksitations-og emissionsintensiteter og bølgelængder (illustreret i Figur 1(c)) skal elimineres ved fluorescensmikroskopi ved hjælp af det passende valg til et eksitationsfilter, dikromatisk strålesplitter (i reflekteret lysfluorescens) og barriere-eller emissionsfilter. Ellers overvælder det meget lysere eksitationslys det svagere udsendte fluorescenslys og mindsker prøvekontrasten markant.

når elektroner går fra ophidset tilstand til jordtilstand (se afsnittet nedenfor med titlen Molekylær forklaring), er der et tab af vibrationsenergi. Som et resultat forskydes emissionsspektret til længere bølgelængder end eksitationsspektret (bølgelængde varierer omvendt til strålingsenergi). Dette fænomen er kendt som Stokes lov eller Stokes skift. Jo større Stokes skifter, jo lettere er det at adskille eksitationslys fra emissionslys. Emissionsintensitetstoppen er normalt lavere end eksitationstoppen, og emissionskurven er ofte et spejlbillede af eksitationskurven, men skiftet til længere bølgelængder. For at opnå maksimal fluorescensintensitet ophidses fluorochrom normalt ved bølgelængden ved toppen af eksitationskurven, og emissionsdetekteringen vælges ved den maksimale bølgelængde (eller andre bølgelængder valgt af observatøren) af emissionskurven. Valg af eksitationsbølgelængder og emissionsbølgelængder styres af passende filtre. Ved bestemmelse af et optisk systems spektrale respons kræves tekniske korrektioner for at tage hensyn til faktorer som glastransmission og detektorfølsomhedsvariabler for forskellige bølgelængder.

et typisk fluorochromabsorptions-emissionsspektral diagram er illustreret i figur 2. Bemærk, at kurverne for fluorescensintensitet til absorption (normalt svarende til eksitationskurven for rene forbindelser) og emission for dette typiske fluorochrom er noget ens i form. Bølgelængdeforskydningen mellem ophidselse og emission har været kendt siden midten af det nittende århundrede (Stokes-loven). Bemærk også, at eksitations-og emissionskurverne overlapper noget ved den øvre ende af eksitationen og de nedre bølgelængder af emissionskurven.

Fluorescensfilterterninger

Opdag, hvordan variationer i båndpass bølgelængdeområdet for eksitation og barrierefiltre tillader et specifikt bånd af bølgelængder at belyse prøven og derefter passere igennem til detektoren, mens alle andre er udelukket.

adskillelsen af eksitations-og emissionsbølgelængder opnås ved korrekt valg af filtre til at blokere eller passere specifikke bølgelængder af spektret som vist i figur 3. Designet af fluorescensbelysningsapparater er baseret på kontrol af eksitationslys og emissionslys ved let udskiftelige filterindsatser i lysstien på vej mod prøven og derefter stammer fra prøven. I betragtning af lave emissionsintensiteter er det vigtigt, at den lyskilde, der vælges til ophidselse, har tilstrækkelig lysstyrke, så det relativt svage emissionslys kan maksimeres, og at fluorokromer med tilfredsstillende absorption og udbytte vælges.

den effektivitet, hvormed fluorochrom absorberer eksitationslyset, er kendt som udryddelseskoefficienten. Jo større udryddelseskoefficient, desto større er muligheden for lysabsorption i et givet bølgelængdeområde (en forudsætning for efterfølgende fluorescensemission). Udbyttet af udsendt lys kaldes kvanteudbyttet, forholdet mellem antallet af kvanter (“pakker” af energi) udsendt sammenlignet med antallet af absorberede kvanter (normalt er udbyttet mellem 0,1 og 0,9). Kvanteudbytter under 1 er resultatet af tab af energi gennem ikke-strålingsveje (såsom varme eller en fotokemisk reaktion) snarere end fluorescens genstrålende vej. Nedenfor i tabel 1 er fluorescenskvantumudbytter for en gruppe udvalgte fluorokromer. Bemærk, at nogle kvanteudbytter virker trivielle, mens andre er meget effektive (Fluorescein og Rhodamin-B).

Fluorochrom fluorescens kvante udbytter
forbindelse opløsningsmiddel spænding
bølgelængde
(nm)
Emission
bølgelængde
(nm)
Kvanteudbytte
Acridin Orange Ethanol 493 535 0.46
Bensin Ethanol 248 300-350 0.04
Klorofyl-A Ethanol 440 685 0.23
Eosin Vand 521 544 0.16
Fluorescein Vand 437 515 0.92
Rhodamin-B Ethanol 555 627 0.97
tabel 1

Udryddelseskoefficient, kvanteudbytte, gennemsnitlig lysstyrke for lyskilden og fluorescens levetid er alle vigtige faktorer, der bidrager til intensiteten og nytten af fluorescensemission. Derudover spiller det lokaliserede miljø, der omgiver fluorochrom, en afgørende rolle i bestemmelsen af egenskaberne ved fluorescensemission. Variabler såsom opløsningsmiddelviskositet, Ioniske koncentrationer, pH og hydrofobicitet i miljøet kan have dybe virkninger på både fluorescensintensiteten og levetiden for den ophidsede tilstand.

Molekylær forklaring af fluorescens

Fluorescensaktivitet er undertiden afbildet diagrammatisk som vist i figur 4(A) (betegnet et Jablonski-energidiagram). Før ophidselse beskrives den elektroniske konfiguration af molekylet som værende i jordtilstand. Efter absorption af en foton af eksitationslys, normalt med korte bølgelængder, kan elektroner hæves til en højere energi-og vibrationsstimuleret tilstand, en proces, der kun kan tage en Kvadrilliontedel af et sekund (en tidsperiode, der almindeligvis betegnes som en femtosekund, 10e-15 sekunder).

i fluorescens kan de ophidsede elektroner i et interval på cirka en Billiontedel af et sekund (et picosekund eller 10e-12 sekunder) miste noget vibrationsenergi til det omgivende miljø og vende tilbage til det, der kaldes den laveste ophidsede singlettilstand. Fra den laveste ophidsede singlettilstand er elektronerne derefter i stand til at” slappe af ” tilbage til jordtilstanden med samtidig emission af fluorescerende lys som illustreret i figur 4(A). Det udsendte lys har altid længere bølgelængde end eksitationslyset (Stokes-loven) og fortsætter, så længe eksitationsbelysningen bader det fluorescerende eksemplar. Hvis den spændende stråling stoppes, ophører fluorescensen.

Jablonski Energy Diagram

Udforsk, hvordan en elektron absorberer energi og transcenderer til en højere energitilstand ifølge et Jablonski energy-level diagram. Når en elektron er i ophidset tilstand, slapper den langsomt af gennem vibrationseffekter og kan derefter falde tilbage til jordtilstanden ved at udsende en foton (fluorescens).

lejlighedsvis foretager de ophidsede elektroner i stedet for at slappe af til den laveste enkelttilstand gennem vibrationsinteraktioner en forbudt overgang til den afsluttede triplettilstand og derefter til jordtilstanden i en proces, hvor emissionen af stråling kan være betydeligt forsinket-op til flere sekunder eller mere. Dette fænomen er karakteristisk for phosphorescens, som vist i figur 4(b). I nogle tilfælde, de ophidsede elektroner kan gå fra triplettilstanden tilbage til den laveste ophidsede singlettilstand og derefter vende tilbage til jordtilstanden, efterfølgende udsender fluorescerende lys. Denne handling tager lidt længere tid (CA.et mikrosekund eller to) end normalt fluorescens og kaldes forsinket fluorescens(figur 4 (c)). Under andre omstændigheder (f.eks. fotoblegning eller tilstedeværelse af salte af tungmetaller eller andre kemikalier) kan det udsendte lys reduceres væsentligt eller helt standses som beskrevet nedenfor.

Fading eller fotoblegning

der er specifikke forhold, der kan påvirke lysstråling af lys ved en ophidset fluorofor og dermed reducere intensiteten af fluorescens. Denne reduktion af emissionsintensitet kaldes generelt fading eller fotoblegning. Nogle forfattere yderligere opdele fading i slukning og blegning. Blegning er irreversibel nedbrydning af de fluorescerende molekyler på grund af lysintensitet i nærvær af molekylært ilt. Slukning resulterer også i reduceret fluorescensintensitet og opstår ofte som et resultat af iltningsmidler eller tilstedeværelsen af salte af tungmetaller eller halogenforbindelser.

ofte er slukning resultatet af overførsel af energi til andre acceptormolekyler fysisk tæt på de ophidsede fluoroforer, et fænomen kendt som resonansenergioverførsel. Dette særlige fænomen er blevet grundlaget for en nyere teknik til måling af afstande langt under lysmikroskopets laterale opløsning.

forekomsten af blegning har ført til en teknik kendt som Frap eller fluorescensgenopretning efter fotoblegning. FRAP er baseret på blegning ved korte laserudbrud og efterfølgende observation af genvinding af fluorescens forårsaget af diffusion af fluoroforer i det blegede område.

egenskaber af populære AntiFade reagenser
AntiFade reagens
p-phenylen-
diamin
det mest effektive reagens til FITC. Også effektiv til Rhodamin. Bør justeres til 0, 1% p-phenylendiamin i glycerol/PBS til brug. Reagens bliver sort, når det udsættes for lyseksponering, så det skal opbevares på et mørkt sted. Hudkontakt er yderst farlig.
DABCO
(1,4-diasabi-
cyclo-2,2,2-
octan)
yderst effektiv til FITC. Selvom dens virkning er lidt lavere end p-phenylendiamin, er den mere modstandsdygtig over for lys og har et højere sikkerhedsniveau.
n-propylgallat det mest effektive reagens til Rhodamin, også effektivt til FITC. Bør justeres til 1% propylgallat i glycerol/PBS til brug.
2-mercapto –
ethylamin
bruges til at observere kromosom-og DNA-prøver farvet med propidiumiodid, acridinorange eller Chromomysin A3. Bør justeres til 0,1 mM 2-mercaptotheylamin i Tris-EDTA
tabel 2

for at reducere graden af fading i nogle prøver kan det være tilrådeligt at bruge et neutralt densitetsfilter i lysstien, før belysningen når eksitationsfilteret, hvilket mindsker eksitationslysintensiteten. I andre tilfælde kan Falmende virkninger reduceres ved at ændre pH i monteringsmediet eller ved hjælp af antiblegemidler (flere af de vigtigere stoffer er anført i tabel 2). Ved digital billeddannelse, fotomikrografi eller simpelthen visuel observation kan hurtigt ændring af synsfeltet også undgå Falmende effekter.

Bidragende Forfattere

Mortimer – Olympus America, Inc., To Corporate Center Drev., Melville, 11747.

Michael Davidson-Nationalt Højmagnetisk Feltlaboratorium, 1800 East Paul Dirac Dr., Florida State University, Tallahassee, Florida, 32310.

Skriv et svar

Din e-mailadresse vil ikke blive publiceret.