Aufgrund ihrer neuartigen elektronischen Konfigurationen haben Fluorochrome einzigartige und charakteristische Spektren für Absorption (normalerweise ähnlich der Anregung) und Emission. Diese Absorptions- und Emissionsspektren zeigen die relative Intensität der Fluoreszenz, wobei die relative Intensität klassisch auf der vertikalen Achse gegenüber der Wellenlänge auf der horizontalen Achse aufgetragen ist. Für ein gegebenes Fluorochrom geben die Hersteller die Wellenlänge für den Peak der Beleuchtungsanregungsintensität und die Wellenlänge für den Peak der Fluoreszenzemissionsintensität an. Es ist wichtig, den Ursprung der Diagramme und Kurven zu verstehen, die die Anregungs- und Emissionsspektren für ein bestimmtes Fluorochrom anzeigen.

Um das Emissionsspektrum eines bestimmten Fluorochroms zu bestimmen, wird die Wellenlänge der maximalen Absorption (normalerweise gleich dem Anregungsmaximum) bestimmt und das Fluorochrom wird bei dieser Wellenlänge angeregt. Das Absorptionsspektrum eines typischen Fluorochroms ist in Abbildung 1 (a) dargestellt, wo die relative Absorptionsintensität gegen die gemessene Wellenlänge aufgetragen ist. Ein Monochromator (ein Gerät, das schmale Bänder von Lichtwellenlängen passieren lässt) wird dann verwendet, um die Fluoreszenzemissionsintensität über die gesamte Reihe von Emissionswellenlängen abzutasten. Die relative Intensität der Fluoreszenz wird bei den verschiedenen Wellenlängen gemessen, um das Emissionsspektrum aufzuzeichnen, wie in Abbildung 1 (b) dargestellt. Das Anregungsspektrum eines gegebenen Fluorochroms wird in ähnlicher Weise bestimmt, indem die Fluoreszenzemission bei der Wellenlänge maximaler Intensität überwacht wird, während der Fluorophor durch eine Gruppe aufeinanderfolgender Wellenlängen angeregt wird. Das Emissionsmaximum wird gewählt und nur Emissionslicht mit dieser Wellenlänge darf zum Detektor gelangen. Es wird eine Anregung (üblicherweise mittels eines Monochromators) bei verschiedenen Anregungswellenlängen induziert und die Intensität der emittierten Fluoreszenz wellenlängenabhängig gemessen. Das Ergebnis ist ein Diagramm oder eine Kurve (dargestellt in Abbildung 1 (a)), die die relative Fluoreszenzintensität darstellt, die durch Anregung über das Spektrum der Anregungswellenlängen erzeugt wird.

Fluoreszenzfilterspektren

Untersuchen Sie die Überlappungsbereiche von Fluoreszenzanregungs-, Emissions- und dichromatischen Filterspektralprofilen und wie Änderungen der Transmissionseigenschaften die Bandbreite von Wellenlängen bestimmen, die durch verschiedene Filterkombinationen geleitet werden.

Aus einem typischen Anregungs- und Emissionssatz von Kurven oder Spektren können mehrere Beobachtungen gemacht werden. Üblicherweise besteht eine Überlappung zwischen dem höheren Wellenlängenende des Anregungsspektrums und dem unteren Wellenlängenende des Emissionsspektrums. Diese Überlappung von Anregungs- und Emissionsintensitäten und Wellenlängen (dargestellt in Abbildung 1 (c)) muss in der Fluoreszenzmikroskopie durch die entsprechende Auswahl eines Anregungsfilters, eines dichromatischen Strahlteilers (bei Auflichtfluoreszenz) und eines Barriere- oder Emissionsfilters beseitigt werden. Andernfalls überwältigt das viel hellere Anregungslicht das schwächere emittierte Fluoreszenzlicht und verringert den Probenkontrast signifikant.

Wenn Elektronen vom angeregten Zustand in den Grundzustand übergehen (siehe Abschnitt Molekulare Erklärung), kommt es zu einem Verlust an Schwingungsenergie. Dadurch wird das Emissionsspektrum auf längere Wellenlängen verschoben als das Anregungsspektrum (Wellenlänge variiert umgekehrt zur Strahlungsenergie). Dieses Phänomen ist als Stokes-Gesetz oder Stokes-Verschiebung bekannt. Je größer die Stokes-Verschiebung ist, desto einfacher ist es, Anregungslicht von Emissionslicht zu trennen. Die Emissionsintensitätsspitze ist normalerweise niedriger als die Anregungsspitze, und die Emissionskurve ist häufig ein Spiegelbild der Anregungskurve, jedoch zu längeren Wellenlängen verschoben. Um eine maximale Fluoreszenzintensität zu erreichen, wird das Fluorochrom üblicherweise bei der Wellenlänge am Peak der Anregungskurve angeregt, und die Emissionsdetektion wird bei der Peakwellenlänge (oder anderen vom Beobachter gewählten Wellenlängen) der Emissionskurve ausgewählt. Die Auswahl von Anregungswellenlängen und Emissionswellenlängen wird durch geeignete Filter gesteuert. Bei der Bestimmung der spektralen Antwort eines optischen Systems sind technische Korrekturen erforderlich, um Faktoren wie Glasdurchlässigkeit und Detektorempfindlichkeitsvariablen für verschiedene Wellenlängen zu berücksichtigen.

Ein typisches Fluorochrom-Absorptions-Emissions-Spektraldiagramm ist in Abbildung 2 dargestellt. Beachten Sie, dass die Kurven der Fluoreszenzintensität für Absorption (normalerweise ähnlich der Anregungskurve für reine Verbindungen) und Emission für dieses typische Fluorochrom in ihrer Form etwas ähnlich sind. Die Wellenlängenverschiebung zwischen Anregung und Emission ist seit Mitte des neunzehnten Jahrhunderts bekannt (Stokes-Gesetz). Beachten Sie auch, dass sich die Anregungs- und Emissionskurven am oberen Ende der Anregung und den unteren Wellenlängen der Emissionskurve etwas überlappen.

Fluoreszenzfilterwürfel

Entdecken Sie, wie Variationen im Bandpasswellenlängenbereich von Anregungs- und Sperrfiltern es einem bestimmten Wellenlängenband ermöglichen, die Probe zu beleuchten und dann zum Detektor zu gelangen, während alle anderen ausgeschlossen sind.

Die Trennung von Anregungs- und Emissionswellenlängen wird durch die richtige Auswahl von Filtern erreicht, um bestimmte Wellenlängen des Spektrums zu blockieren oder durchzulassen, wie in Abbildung 3 dargestellt. Das Design von Fluoreszenzbeleuchtungsgeräten basiert auf der Steuerung von Anregungslicht und Emissionslicht durch leicht veränderbare Filtereinsätze in den Lichtweg auf dem Weg zur Probe und dann von der Probe ausgehend. Im Hinblick auf niedrige Emissionsintensitäten ist es wichtig, dass die zur Anregung gewählte Lichtquelle eine ausreichende Helligkeit aufweist, so dass das relativ schwache Emissionslicht maximiert werden kann, und dass Fluorochrome mit zufriedenstellender Absorption und Ausbeute gewählt werden.

Die Effizienz, mit der das Fluorochrom das Anregungslicht absorbiert, wird als Extinktionskoeffizient bezeichnet. Je größer der Extinktionskoeffizient ist, desto größer ist die Möglichkeit der Lichtabsorption in einem gegebenen Wellenlängenbereich (Voraussetzung für die nachfolgende Fluoreszenzemission). Die Ausbeute an emittiertem Licht wird als Quantenausbeute bezeichnet, das Verhältnis der Anzahl der emittierten Quanten („Energiepakete“) zur Anzahl der absorbierten Quanten (normalerweise liegt die Ausbeute zwischen 0,1 und 0,9). Quantenausbeuten unter 1 sind das Ergebnis des Energieverlusts durch nicht strahlende Wege (wie Wärme oder eine photochemische Reaktion) und nicht durch den rückstrahlenden Weg der Fluoreszenz. Nachfolgend sind in Tabelle 1 Fluoreszenzquantenausbeuten für eine Gruppe ausgewählter Fluorochrome aufgeführt. Beachten Sie, dass einige Quantenausbeuten trivial erscheinen (Benzol), während andere sehr effizient sind (Fluorescein und Rhodamin-B).

Fluorochrom-Fluoreszenz-Quantenausbeuten
Verbindung Lösungsmittel Anregung
Wellenlänge
(nm)
Emission
Wellenlänge
(nm)
Quantenausbeute
Acridinorange Ethanol 493 535 0.46
Benzol Ethanol 248 300-350 0.04
Chlorophyll-A Ethanol 440 685 0.23
Eosin Wasser 521 544 0.16
Fluorescein Wasser 437 515 0.92
Rhodamin-B Ethanol 555 627 0.97
Tabelle 1

Extinktionskoeffizient, Quantenausbeute, mittlere Lichtstärke der Lichtquelle und Fluoreszenzlebensdauer sind wichtige Faktoren, die zur Intensität und Nützlichkeit der Fluoreszenzemission beitragen. Darüber hinaus spielt die lokalisierte Umgebung, die das Fluorochrom umgibt, eine entscheidende Rolle bei der Bestimmung der Eigenschaften der Fluoreszenzemission. Variablen wie Lösungsmittelviskosität, Ionenkonzentrationen, pH-Wert und Hydrophobie in der Umgebung können tiefgreifende Auswirkungen sowohl auf die Fluoreszenzintensität als auch auf die Lebensdauer des angeregten Zustands haben.

Molekulare Erklärung der Fluoreszenz

Die Fluoreszenzaktivität wird manchmal schematisch dargestellt, wie in Abbildung 4 (a) gezeigt (als Jablonski-Energiediagramm bezeichnet). Vor der Anregung wird die elektronische Konfiguration des Moleküls als im Grundzustand befindlich beschrieben. Beim Absorbieren eines Photons von Anregungslicht, normalerweise von kurzen Wellenlängen, können Elektronen in einen höheren Energie- und Schwingungserregungszustand versetzt werden, ein Prozess, der nur ein Billiardstel einer Sekunde dauern kann (ein Zeitraum, der allgemein als Femtosekunde bezeichnet wird, 10E-15 Sekunden).

In der Fluoreszenz können die angeregten Elektronen während eines Intervalls von ungefähr einer Billionstel Sekunde (einer Pikosekunde oder 10E-12 Sekunden) etwas Schwingungsenergie an die Umgebung verlieren und in den sogenannten niedrigsten angeregten Singulettzustand zurückkehren. Aus dem niedrigsten angeregten Singulettzustand können sich die Elektronen dann bei gleichzeitiger Emission von Fluoreszenzlicht zurück in den Grundzustand „entspannen“, wie in Abbildung 4 (a) dargestellt. Das emittierte Licht ist immer längerwellig als das Anregungslicht (Stokes-Gesetz) und dauert so lange an, wie die Anregungsbeleuchtung die Fluoreszenzprobe badet. Wird die anregende Strahlung gestoppt, hört die Fluoreszenz auf.

Jablonski-Energiediagramm

Untersuchen Sie, wie ein Elektron Energie absorbiert und gemäß einem Jablonski-Energieniveaudiagramm in einen höheren Energiezustand übergeht. Sobald sich ein Elektron im angeregten Zustand befindet, entspannt es sich langsam durch Schwingungseffekte und kann dann durch Aussenden eines Photons (Fluoreszenz) in den Grundzustand zurückfallen.

Gelegentlich machen die angeregten Elektronen, anstatt sich durch Schwingungswechselwirkungen in den niedrigsten Singulettzustand zu entspannen, einen verbotenen Übergang in den ausgetretenen Triplettzustand und dann in den Grundzustand in einem Prozess, bei dem die Emission von Strahlung erheblich verzögert sein kann – bis zu einigen Sekunden oder mehr. Dieses Phänomen ist charakteristisch für Phosphoreszenz, wie in Abbildung 4 (b) gezeigt. In einigen Fällen können die angeregten Elektronen vom Triplettzustand zurück in den niedrigsten angeregten Singulettzustand übergehen und dann in den Grundzustand zurückkehren, wobei anschließend Fluoreszenzlicht emittiert wird. Diese Aktion dauert etwas länger (etwa eine oder zwei Mikrosekunden) als die übliche Fluoreszenz und wird als verzögerte Fluoreszenz bezeichnet (Abbildung 4 (c)). Unter anderen Umständen (z. B. Photobleichung oder die Anwesenheit von Salzen von Schwermetallen oder anderen Chemikalien) kann das emittierte Licht signifikant reduziert oder ganz gestoppt werden, wie unten diskutiert.

Fading oder Photobleaching

Es gibt bestimmte Bedingungen, die die Rückstrahlung von Licht durch einen angeregten Fluorophor beeinflussen und somit die Intensität der Fluoreszenz verringern können. Diese Verringerung der Emissionsintensität wird allgemein als Fading oder Photobleaching bezeichnet. Einige Autoren unterteilen das Verblassen weiter in Abschrecken und Bleichen. Bleichen ist eine irreversible Zersetzung der fluoreszierenden Moleküle aufgrund der Lichtintensität in Gegenwart von molekularem Sauerstoff. Das Quenchen führt ebenfalls zu einer verminderten Fluoreszenzintensität und wird häufig durch Oxidationsmittel oder die Anwesenheit von Salzen von Schwermetallen oder Halogenverbindungen bewirkt.

Häufig resultiert das Quenchen aus der Übertragung von Energie auf andere Akzeptormoleküle, die physikalisch nahe an den angeregten Fluorophoren liegen, ein Phänomen, das als Resonanzenergietransfer bekannt ist. Dieses spezielle Phänomen ist zur Grundlage für eine neuere Technik geworden, Entfernungen weit unterhalb der lateralen Auflösung des Lichtmikroskops zu messen.

Das Auftreten von Bleichen hat zu einer Technik geführt, die als FRAP oder Fluorescence Recovery after Photobleaching bekannt ist. FRAP basiert auf dem Bleichen durch kurze Laserstöße und anschließender Beobachtung der Wiederherstellung der Fluoreszenz, die durch die Diffusion von Fluorophoren in den gebleichten Bereich verursacht wird.

Eigenschaften beliebter Antifade-Reagenzien
Antifade-Reagenz
p-Phenylen-
Diamin
Das wirksamste Reagenz für FITC. Auch wirksam für Rhodamin. Sollte zur Verwendung auf 0,1% p-Phenylendiamin in Glycerin / PBS eingestellt werden. Reagenz schwärzt, wenn es Belichtung unterworfen wird, also sollte es in einem dunklen Platz gespeichert werden. Hautkontakt ist extrem gefährlich.
DABCO
(1,4-diazabi-
cyclo-2,2,2-
octan)
Hochwirksam für FITC. Obwohl seine Wirkung etwas geringer ist als die von p-Phenylendiamin, ist es lichtbeständiger und bietet ein höheres Maß an Sicherheit.
n-Propylgallat Das wirksamste Reagenz für Rhodamin, auch wirksam für FITC. Sollte zur Verwendung auf 1% Propylgallat in Glycerin / PBS eingestellt werden.
2- mercapto-
Ethylamin
Zur Beobachtung von Chromosomen- und DNA-Proben, die mit Propidiumiodid, Acridinorange oder Chromomysin A3 gefärbt sind. Sollte auf 0,1 mM 2-Mercaptotheylamin in Tris-EDTA eingestellt werden
Tabelle 2

Um den Grad des Verblassens bei einigen Proben zu verringern, kann es ratsam sein, einen Neutraldichtefilter im Lichtpfad zu verwenden, bevor die Beleuchtung den Anregungsfilter erreicht, wodurch die Anregungslichtintensität verringert wird. In anderen Fällen können Verblassungseffekte durch Änderung des pH-Werts des Montagemediums oder durch Verwendung von Antibleichmitteln verringert werden (einige der wichtigeren Mittel sind in Tabelle 2 aufgeführt). Bei der digitalen Bildgebung, der Mikrofotografie oder einfach der visuellen Beobachtung kann eine schnelle Änderung des Sichtfelds auch Fading-Effekte vermeiden.

Beitragende Autoren

Mortimer Abramowitz – Olympus America, Inc., Zwei Corporate Center-Laufwerk., Melville, New York, 11747.

Michael W. Davidson – Nationales Labor für hohe Magnetfelder, 1800 East Paul Dirac Dr., Die Florida State University, Tallahassee, Florida, 32310.

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