Debido a sus nuevas configuraciones electrónicas, los fluorocromos tienen espectros únicos y característicos para la absorción (generalmente similares a la excitación) y la emisión. Estos espectros de absorción y emisión muestran la Intensidad relativa de la fluorescencia, con la intensidad relativa trazada clásicamente en el eje vertical versus la longitud de onda en el eje horizontal. Para un fluorocromo determinado, los fabricantes indican la longitud de onda para el pico de intensidad de excitación de iluminación y la longitud de onda para el pico de intensidad de emisión de fluorescencia. Es importante comprender el origen de los gráficos y curvas que muestran los espectros de excitación y emisión para un fluorocromo determinado.

Para determinar el espectro de emisión de un fluorocromo en particular, se determina la longitud de onda de absorción máxima (generalmente la misma que el máximo de excitación) y el fluorocromo se excita a esa longitud de onda. El espectro de absorción de un fluorocromo típico se ilustra en la Figura 1 (a), donde se representa la intensidad relativa de absorción en relación con la longitud de onda medida. A continuación, se utiliza un monocromador (un dispositivo que permite el paso de bandas estrechas de longitudes de onda de luz) para escanear la intensidad de emisión de fluorescencia en toda la serie de longitudes de onda de emisión. La intensidad relativa de la fluorescencia se mide en las diversas longitudes de onda para trazar el espectro de emisión, como se ilustra en la Figura 1(b). El espectro de excitación de un fluorocromo determinado se determina de manera similar monitoreando la emisión de fluorescencia en la longitud de onda de intensidad máxima, mientras que el fluoróforo se excita a través de un grupo de longitudes de onda consecutivas. Se elige el máximo de emisión y solo se permite que la luz de emisión en esa longitud de onda pase al detector. La excitación se induce (generalmente por medio de un monocromador) en varias longitudes de onda de excitación y la intensidad de la fluorescencia emitida se mide en función de la longitud de onda. El resultado es un gráfico o curva (ilustrado en la Figura 1 (a)), que representa la intensidad de fluorescencia relativa producida por la excitación en el espectro de longitudes de onda de excitación.

Espectros de filtro de fluorescencia

Explore las regiones de superposición de los perfiles espectrales de excitación, emisión y filtro dicromático de fluorescencia y cómo los cambios en las características de transmisión determinan el ancho de banda de las longitudes de onda pasadas a través de varias combinaciones de filtros.

Se pueden hacer varias observaciones a partir de un conjunto típico de curvas o espectros de excitación y emisión. Por lo general, hay una superposición entre el extremo de mayor longitud de onda del espectro de excitación y el extremo de menor longitud de onda del espectro de emisión. Esta superposición de intensidades y longitudes de onda de excitación y emisión (ilustrada en la Figura 1(c)) debe eliminarse, en microscopía de fluorescencia, mediante la selección adecuada de un filtro de excitación, divisor de haz dicromático (en fluorescencia de luz reflejada) y filtro de barrera o emisión. De lo contrario, la luz de excitación mucho más brillante abruma a la luz de fluorescencia emitida más débil y disminuye significativamente el contraste de la muestra.

Cuando los electrones pasan del estado excitado al estado fundamental (vea la sección más abajo titulada Explicación molecular), hay una pérdida de energía vibratoria. Como resultado, el espectro de emisión se desplaza a longitudes de onda más largas que el espectro de excitación (la longitud de onda varía inversamente a la energía de radiación). Este fenómeno se conoce como Ley de Stokes o cambio de Stokes. Cuanto mayor sea el desplazamiento de los Stokes, más fácil será separar la luz de excitación de la luz de emisión. El pico de intensidad de emisión es generalmente más bajo que el pico de excitación, y la curva de emisión es a menudo una imagen especular de la curva de excitación, pero desplazada a longitudes de onda más largas. Para lograr la máxima intensidad de fluorescencia, el fluorocromo generalmente se excita en la longitud de onda en el pico de la curva de excitación, y la detección de emisiones se selecciona en la longitud de onda máxima (u otras longitudes de onda elegidas por el observador) de la curva de emisión. Las selecciones de longitudes de onda de excitación y longitudes de onda de emisión se controlan mediante filtros apropiados. Al determinar la respuesta espectral de un sistema óptico, se requieren correcciones técnicas para tener en cuenta factores como la transmisión de vidrio y las variables de sensibilidad del detector para diferentes longitudes de onda.

En la Figura 2 se ilustra un diagrama espectral típico de absorción y emisión de fluorocromo. Tenga en cuenta que las curvas de intensidad de fluorescencia para la absorción (generalmente similares a la curva de excitación para compuestos puros) y la emisión para este fluorocromo típico son algo similares en forma. El cambio de longitud de onda entre la excitación y la emisión se conoce desde mediados del siglo XIX (Ley de Stokes). También tenga en cuenta que las curvas de excitación y emisión se superponen un poco en el extremo superior de la excitación y las longitudes de onda inferiores de la curva de emisión.

Cubos de filtro de fluorescencia

Descubra cómo las variaciones en la región de longitud de onda de paso de banda de los filtros de excitación y barrera permiten que una banda específica de longitudes de onda ilumine la muestra y luego pase al detector mientras se excluyen todas las demás.

La separación de longitudes de onda de excitación y emisión se logra mediante la selección adecuada de filtros para bloquear o pasar longitudes de onda específicas del espectro, como se muestra en la Figura 3. El diseño de los iluminadores de fluorescencia se basa en el control de la luz de excitación y la luz de emisión mediante inserciones de filtros fácilmente intercambiables en la trayectoria de la luz en el camino hacia la muestra y luego emanando de la muestra. Es importante, en vista de las bajas intensidades de emisión, que la fuente de luz elegida para la excitación tenga un brillo suficiente para maximizar la luz de emisión relativamente débil, y que se elijan fluorocromos de absorción y rendimiento satisfactorios.

La eficiencia con la que el fluorocromo absorbe la luz de excitación se conoce como coeficiente de extinción. Cuanto mayor sea el coeficiente de extinción, mayor será la posibilidad de absorción de luz en una región de longitud de onda dada (un requisito previo para la consiguiente emisión de fluorescencia). El rendimiento de la luz emitida se conoce como rendimiento cuántico, la relación entre el número de cuantos («paquetes» de energía) emitidos en comparación con el número de cuantos absorbidos (por lo general, el rendimiento está entre 0,1 y 0,9). Los rendimientos cuánticos inferiores a 1 son el resultado de la pérdida de energía a través de vías no radiativas (como calor o una reacción fotoquímica) en lugar de la vía re-radiativa de fluorescencia. A continuación, en la Tabla 1, se enumeran los rendimientos cuánticos de fluorescencia para un grupo de fluorocromos seleccionados. Observe que algunos rendimientos cuánticos parecen triviales (benceno) mientras que otros son muy eficientes (fluoresceína y Rodamina-B).

Fluorocromo Rendimientos Cuánticos de Fluorescencia
Compuesto Disolvente Excitación
longitud de Onda
(nm)
Emisión de
longitud de Onda
(nm)
Rendimiento Cuántico
Naranja de Acridina Etanol 493 535 0.46
El Benceno Etanol 248 300-350 0.04
La Clorofila-A Etanol 440 685 0.23
Eosina Agua 521 544 0.16
Fluoresceína Agua 437 515 0.92
La Rodamina-B Etanol 555 627 0.97
Cuadro 1

El coeficiente de extinción, el rendimiento cuántico, la intensidad luminosa media de la fuente de luz y la vida útil de la fluorescencia son factores importantes que contribuyen a la intensidad y utilidad de la emisión de fluorescencia. Además, el entorno localizado que rodea al fluorocromo desempeña un papel primordial en la determinación de las características de la emisión de fluorescencia. Variables como la viscosidad del disolvente, las concentraciones iónicas, el pH y la hidrofobicidad en el medio ambiente pueden tener efectos profundos tanto en la intensidad de fluorescencia como en la vida útil del estado excitado.

Explicación molecular de la fluorescencia

La actividad de fluorescencia a veces se representa de forma esquemática como se muestra en la Figura 4 (a) (denominado diagrama de energía de Jablonski). Antes de la excitación, la configuración electrónica de la molécula se describe como en estado fundamental. Al absorber un fotón de luz de excitación, generalmente de longitudes de onda cortas, los electrones pueden elevarse a un estado excitado de energía y vibración más alto, un proceso que solo puede tomar una cuadrillonésima de segundo (un período de tiempo comúnmente conocido como femtosegundo, 10E-15 segundos).

En fluorescencia, durante un intervalo de aproximadamente una trillonésima de segundo (un picosegundo o 10E-12 segundos), los electrones excitados pueden perder algo de energía vibratoria al entorno circundante y regresar a lo que se llama el estado singlete excitado más bajo. Desde el estado singlete excitado más bajo, los electrones pueden «relajarse» de vuelta al estado fundamental con emisión simultánea de luz fluorescente, como se ilustra en la Figura 4(a). La luz emitida es siempre de longitud de onda más larga que la luz de excitación (Ley de Stokes) y continúa mientras la iluminación de excitación baña la muestra fluorescente. Si se detiene la radiación excitante, la fluorescencia cesa.

Diagrama de energía de Jablonski

Explore cómo un electrón absorbe energía y trasciende a un estado de energía superior de acuerdo con un diagrama de nivel de energía de Jablonski. Una vez que un electrón está en el estado excitado, se relaja lentamente a través de efectos vibratorios y luego puede volver al estado fundamental emitiendo un fotón (fluorescencia).

Ocasionalmente, los electrones excitados, en lugar de relajarse al estado singlete más bajo a través de interacciones vibratorias, hacen una transición prohibida al estado triplete de salida y luego al estado fundamental en un proceso donde la emisión de radiación puede retrasarse considerablemente, hasta varios segundos o más. Este fenómeno es característico de la fosforescencia, como se muestra en la Figura 4(b). En algunos casos, los electrones excitados pueden pasar del estado triplete al estado singlete excitado más bajo y luego regresar al estado fundamental, emitiendo posteriormente luz fluorescente. Esta acción toma un poco más de tiempo (aproximadamente un microsegundo o dos) que la fluorescencia habitual y se denomina fluorescencia retardada (Figura 4(c)). En otras circunstancias (por ejemplo, el fotoblanqueo o la presencia de sales de metales pesados u otros productos químicos), la luz emitida puede reducirse significativamente o detenerse por completo, como se explica a continuación.

Decoloración o fotoblanqueo

Hay condiciones específicas que pueden afectar la re-radiación de la luz por un fluoróforo excitado, y por lo tanto reducir la intensidad de la fluorescencia. Esta reducción de la intensidad de emisión generalmente se denomina decoloración o fotoblanqueo. Algunos autores subdividen el desvanecimiento en enfriamiento y blanqueamiento. El blanqueo es la descomposición irreversible de las moléculas fluorescentes debido a la intensidad de la luz en presencia de oxígeno molecular. El enfriamiento también resulta en una intensidad de fluorescencia reducida y con frecuencia se produce como resultado de agentes oxidantes o la presencia de sales de metales pesados o compuestos halógenos.

A menudo, el enfriamiento resulta de la transferencia de energía a otras moléculas aceptoras físicamente cercanas a los fluoróforos excitados, un fenómeno conocido como transferencia de energía de resonancia. Este fenómeno en particular se ha convertido en la base de una nueva técnica de medición de distancias muy por debajo de la resolución lateral del microscopio de luz.

La aparición de blanqueamiento ha llevado a una técnica conocida como FRAP, o recuperación de fluorescencia después del fotoblanqueo. El FRAP se basa en el blanqueo por ráfagas de láser cortas y la observación posterior de la recuperación de fluorescencia causada por la difusión de fluoróforos en el área blanqueada.

Propiedades de los Reactivos Antifadados Populares
Reactivo Antifadado
p-fenileno-
diamina
El reactivo más eficaz para FITC. También es eficaz para la rodamina. Debe ajustarse al 0,1% de p-fenilendiamina en glicerol / PBS para su uso. El reactivo se ennegrece cuando se expone a la luz, por lo que debe almacenarse en un lugar oscuro. El contacto con la piel es extremadamente peligroso.
DABCO
(1,4-diazabi-
cyclo-2,2,2-
octano)
Altamente eficaz para FITC. Aunque su efecto es ligeramente inferior al de la p-fenilendiamina, es más resistente a la luz y presenta un mayor nivel de seguridad.
n-propilgalato El reactivo más efectivo para rodamina, también efectivo para FITC. Debe ajustarse al 1% de propilgalato en glicerol / PBS para su uso.
2-mercapto –
etilamina
Se utiliza para observar muestras de cromosomas y ADN teñidas con yoduro de propidio, naranja acridina o cromomisina A3. Debe ajustarse a 2-mercaptoteilamina de 0,1 mm en Tris-EDTA
Cuadro 2

Para reducir el grado de decoloración en algunas muestras, puede ser aconsejable usar un filtro de densidad neutra en la trayectoria de la luz antes de que la iluminación alcance el filtro de excitación, disminuyendo así la intensidad de la luz de excitación. En otros casos, los efectos de decoloración pueden reducirse cambiando el pH del medio de montaje o utilizando agentes antiblanqueantes (varios de los agentes más importantes se enumeran en la Tabla 2). Para imágenes digitales, fotomicrografía o simplemente observación visual, cambiar rápidamente el campo de visión también puede evitar efectos de desvanecimiento.

Autores colaboradores

Mortimer Abramowitz-Olympus America, Inc., Two Corporate Center Drive., Melville, Nueva York, 11747.

Michael W. Davidson-Laboratorio Nacional de Alto Campo Magnético, 1800 East Paul Dirac Dr., La Universidad Estatal de Florida, Tallahassee, Florida, 32310.

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