uusien elektronisten konfiguraatioidensa vuoksi fluorokromeilla on ainutlaatuinen ja ominainen spektri absorptiolle (yleensä samanlainen kuin eksitaatiolla) ja emissiolle. Nämä absorptio-ja emissiospektrit osoittavat fluoresenssin suhteellista intensiteettiä, kun suhteellinen intensiteetti piirretään klassisesti pystyakselille vs. aallonpituus vaaka-akselille. Tietyn fluorokromin osalta valmistajat ilmoittavat valaistuksen magnetointitehon huipun aallonpituuden ja fluoresenssiemissioiden voimakkuuden huipun aallonpituuden. On tärkeää ymmärtää tietyn fluorokromin magnetointi-ja emissiospektriä esittävien kuvaajien ja käyrien alkuperä.

tietyn fluorokromin emissiospektrin määrittämiseksi määritetään maksimiabsorption aallonpituus (yleensä sama kuin eksitaatiomaksimi) ja fluorokromia jännitetään kyseisellä aallonpituudella. Tyypillisen fluorokromin absorptiospektri esitetään kuvassa 1(a), jossa absorption suhteellinen intensiteetti piirretään mitattuun aallonpituuteen. Tämän jälkeen käytetään monokromaattoria (laitetta, joka mahdollistaa kapeiden valon aallonpituuskaistojen läpäisemisen) fluoresenssiemissioiden intensiteetin skannaamiseen koko emission aallonpituussarjan ajalta. Fluoresenssin suhteellinen intensiteetti mitataan eri aallonpituuksilla emissiospektrin kuvaamiseksi, kuten kuvassa 1 b esitetään. Tietyn fluorokromin magnetaatiospektri määritetään samalla tavalla seuraamalla fluoresenssiemissiota enimmäisvoimakkuuden aallonpituudella, kun fluorofori on virittynyt ryhmän peräkkäisten aallonpituuksien läpi. Valitaan päästömaksimi, ja vain tällä aallonpituudella oleva emissiovalo pääsee kulkemaan ilmaisimeen. Eksitaatiota indusoidaan (yleensä monokromaattorin avulla) eri magnetoinnin aallonpituuksilla ja emittoituvan fluoresenssin voimakkuus mitataan aallonpituuden funktiona. Tuloksena on kuvaaja tai käyrä(kuviossa 1 (a)), joka kuvaa eksitaation tuottamaa suhteellista fluoresenssin intensiteettiä eksitaation aallonpituuksien spektrissä.

Fluoresenssisuodattimen spektrit

tutkitaan fluoresenssisuodattimen eksitaatio -, emissio-ja dikromaattisuodattimen spektriprofiilien päällekkäisiä alueita ja miten lähetysominaisuuksien muutokset määrittävät erilaisten suodatinyhdistelmien läpi kulkevien aallonpituuksien kaistanleveyden.

tyypillisestä eksitaatio-ja emissiojoukosta tai spektristä voidaan tehdä useita havaintoja. Eksitaatiospektrin korkeamman aallonpituuspään ja emissiospektrin alemman aallonpituuspään välillä on yleensä päällekkäisyyttä. Tämä eksitaatio-ja emissiovoimakkuuksien ja aallonpituuksien päällekkäisyys (esitetty kuvassa 1(c)) on poistettava fluoresenssimikroskopiassa valitsemalla asianmukaisesti herätesuodatin, dikromaattinen beamsplitteri (heijastuneen valon fluoresenssissa) ja este tai emissiosuodatin. Muuten paljon kirkkaampi herätevalo peittää heikomman säteilevän fluoresenssivalon ja vähentää merkittävästi näytteiden kontrastia.

kun elektronit menevät viritetystä tilasta maatilaan (katso alla oleva kappale ”Molecular Explanation”), tapahtuu värähtelyenergian menetys. Tämän seurauksena emissiospektri siirtyy pidemmille aallonpituuksille kuin eksitaatiospektri (aallonpituus vaihtelee kääntäen säteilyenergiaan). Tätä ilmiötä kutsutaan Stokesin laiksi tai Stokesin siirroksi. Mitä suurempi Stokesin siirtymä on, sitä helpompi on erottaa herätevalo emissiovalosta. Emission intensiteettihuippu on yleensä magnetointihuippua pienempi, ja emissiokäyrä on usein herätekäyrän peilikuva, mutta siirtynyt pidemmille aallonpituuksille. Fluoresenssin enimmäisintensiteetin saavuttamiseksi fluorokromi jännitetään yleensä magnetointikäyrän huipun aallonpituudella, ja emissiomittaus valitaan emissiokäyrän aallonpituuden huipulla (tai muilla havaitsijan valitsemilla aallonpituuksilla). Eksitaatio-ja emissioaallonpituuksien valikoimia ohjataan sopivilla suodattimilla. Optisen järjestelmän spektrivastetta määritettäessä vaaditaan teknisiä korjauksia, jotta voidaan ottaa huomioon esimerkiksi lasin läpäisy ja ilmaisimen herkkyysmuuttujat eri aallonpituuksilla.

kuviossa 2 esitetään tyypillinen fluorokromin absorptioemissiospektrikaavio. Huomaa, että fluoresenssin intensiteetin käyrät absorptiolle (yleensä samanlaiset kuin puhtaiden yhdisteiden magnetointikäyrä) ja tämän tyypillisen fluorokromin emissiolle ovat muodoltaan jokseenkin samanlaiset. Magnetaation ja emission välinen aallonpituusmuutos on tunnettu 1800-luvun puolivälistä lähtien (Stokesin laki). Huomaa myös, että eksitaatio-ja emissiokäyrät limittyvät jonkin verran eksitaation yläpäässä ja emissiokäyrän alemmilla aallonpituuksilla.

Fluoresenssisuodattimen kuutiot

havaitsevat, miten taajuusalueen aallonpituusalueen muutokset heräte-ja estesuodattimissa mahdollistavat tietyn aallonpituusalueen valaisemisen näytteessä ja läpäisevät sen sitten detektoriin, kun kaikki muut on suljettu pois.

magnetointi-ja emissioaallonpituudet erotetaan toisistaan valitsemalla asianmukaisesti suodattimet, jotka estävät tai läpäisevät spektrin tietyt aallonpituudet, kuten kuvassa 3 esitetään. Fluoresenssivalaisimien rakenne perustuu herätevalon ja emissiovalon ohjaamiseen siten, että valorataan lisätään helposti vaihdettavissa olevia suodattimia matkalla näytettä kohti ja sitten näyte lähtee siitä. Koska emissiovoimakkuus on alhainen, on tärkeää, että valonlähteen kirkkaus on riittävä, jotta suhteellisen heikko emissiovalo voidaan maksimoida, ja että valitaan tyydyttävän absorption ja saannon omaavat fluorokromit.

tehokkuus, jolla fluorokromi absorboi herätevalon, tunnetaan ekstinktiokertoimena. Mitä suurempi ekstinktiokerroin on, sitä suurempi on valon absorptiomahdollisuus tietyllä aallonpituusalueella (joka on edellytys fluoresenssiemissiolle). Säteilevän valon saantoa kutsutaan kvanttisaannoksi, joka on säteilevän kvantan (”energiapakettien”) määrän suhde absorboituneen kvantan määrään (yleensä saanto on 0,1-0,9). Alle 1: n kvanttisadot johtuvat energian menetyksestä ei-säteilevien reittien (kuten lämmön tai valokemiallisen reaktion) kautta eikä fluoresenssin uudelleensäteilevästä reitistä. Taulukossa 1 on lueteltu fluoresenssikvanttisadot valituille fluorokromeille. Huomaa, että jotkut kvanttisadot näyttävät triviaaleilta (bentseeni), kun taas toiset ovat erittäin tehokkaita (Fluoreseiini ja Rodamiini-B).

Fluorochrome Fluoresence Quantum sadot
yhdiste liuotin Magnetaatio
Aallonpituus
(nm)
emissio
Aallonpituus
(nm)
Kvanttisaanto
Akridiinioranssi etanoli 493 535 0.46
bentseeni etanoli 248 300-350 0.04
Klorofylli-A Etanoli 440 685 0.23
Eosin Vesi 521 544 0.16
Fluoreseiini Vesi 437 515 0.92
Rodamiini-B Etanoli 555 627 0.97
Taulukko 1

Ekstinktiokerroin, kvanttisaanto, valonlähteen keskimääräinen valovoima ja fluoresenssin elinikä ovat kaikki tärkeitä tekijöitä, jotka vaikuttavat fluoresenssiemissioiden voimakkuuteen ja hyötyyn. Lisäksi fluorokromia ympäröivällä paikallisella ympäristöllä on ensiarvoisen tärkeä rooli fluoresenssiemissioiden ominaisuuksien määrittämisessä. Muuttujat, kuten liuottimen viskositeetti, ionipitoisuudet, pH ja hydrofobisuus ympäristössä, voivat vaikuttaa merkittävästi sekä fluoresenssin intensiteettiin että jännittyneen tilan elinikään.

fluoresenssin Molekyyliselitys

Fluoresenssiaktiivisuus esitetään joskus kaaviona kuten kuvassa 4(a) (jablonskin energiakaavio). Ennen eksitaatiota molekyylin elektronikonfiguraation kuvataan olevan maatilassa. Kun absorboivat fotonin herätevaloa, yleensä lyhyitä aallonpituuksia, elektronit voidaan nostaa korkeampaan energiaan ja vibrationaaliseen virittyneeseen tilaan, prosessi, joka voi kestää vain sekunnin neljännesmiljoonasosan (ajanjakso, jota yleisesti kutsutaan femtosekunniksi, 10E-15 sekuntia).

fluoresenssissa noin sekunnin biljoonasosan (pikosekunnin tai 10e-12 sekunnin) aikana jännittyneet elektronit saattavat menettää jonkin verran värähtelyenergiaa ympäröivään ympäristöön ja palata niin sanottuun alimpaan virittyneeseen singlettitilaan. Alimmasta jännitteisestä singlettitilasta elektronit voivat sitten ”rentoutua” takaisin maatilaan samanaikaisesti fluoresoivan valon emissiolla, kuten kuvassa 4(a) esitetään. Säteilevän valon aallonpituus on aina pidempi kuin herätevalon (Stokesin laki) ja se jatkuu niin kauan kuin herätevalo kylvettää loisteainetta. Jos jännittävä säteily lakkaa, fluoresenssi lakkaa.

Jablonskin Energiakaavio

tutki, miten elektroni absorboi energiaa ja siirtyy korkeampaan energiatilaan Jablonskin energiatasokaavion mukaan. Kun elektroni on viritetyssä tilassa, se rentoutuu hitaasti värähtelyvaikutusten kautta ja voi sitten pudota takaisin maahan säteilemällä fotonia (fluoresenssi).

silloin tällöin jännittyneet elektronit sen sijaan, että ne rentoutuisivat alimpaan singlettitilaan värähtelyvuorovaikutusten kautta, tekevät kielletyn siirtymisen poistuneeseen triplettitilaan ja sen jälkeen maatilaan prosessissa, jossa säteilypäästö voi viivästyä huomattavasti-jopa useita sekunteja tai enemmän. Ilmiö on tyypillinen fosforesenssille, kuten kuvassa 4 (b) esitetään. Joissakin tapauksissa jännittyneet elektronit saattavat siirtyä triplettitilasta takaisin alimpaan virittyneeseen singlettitilaan ja palata sitten maanpäälliseen tilaan, jolloin syntyy loistevaloa. Tämä toiminta kestää hieman kauemmin (noin mikrosekunnin tai kaksi) kuin tavallinen fluoresenssi, ja sitä kutsutaan viivästyneeksi fluoresenssiksi(Kuva 4 (c)). Muissa olosuhteissa (esimerkiksi valonlähde tai raskasmetallien tai muiden kemikaalien suolojen esiintyminen) säteilevää valoa voidaan vähentää merkittävästi tai se voidaan pysäyttää kokonaan, kuten jäljempänä kuvataan.

haalistuminen tai valoherkkyys

on olemassa erityisolosuhteita, jotka voivat vaikuttaa valon uudelleensäteilyyn innostuneen fluoriforin vaikutuksesta ja siten vähentää fluoresenssin voimakkuutta. Tätä päästöjen intensiteetin vähentämistä kutsutaan yleensä haalistumiseksi tai fotobleachingiksi. Jotkut kirjoittajat edelleen jakaa hiipuminen sammutus ja valkaisu. Valkaisu on fluoresoivien molekyylien irreversiibeliä hajoamista valon voimakkuuden vuoksi molekyylin hapen läsnä ollessa. Sammutus vähentää myös fluoresenssin intensiteettiä, ja se syntyy usein hapettavien aineiden tai raskasmetallien tai halogeeniyhdisteiden suolojen seurauksena.

usein sammuminen johtuu energian siirtymisestä muihin acceptorimolekyyleihin, jotka ovat fyysisesti lähellä kiihtyneitä fluoriforeja, ilmiöstä, jota kutsutaan resonanssienergiansiirroksi. Tästä ilmiöstä on tullut perusta uudemmalle tekniikalle, jolla mitataan etäisyyksiä, jotka ovat paljon valomikroskoopin sivuttaisresoluution alapuolella.

valkaisun esiintyminen on johtanut menetelmään, joka tunnetaan nimellä FRAP eli fluoresenssin talteenotto fotobleachingin jälkeen. FRAP perustuu lyhyillä laserpurkauksilla tapahtuvaan valkaisuun ja sen jälkeen havaittuun fluoresenssin talteenottoon, joka johtuu fluoriforien diffuusiosta valkaistulle alueelle.

suosittujen Antifade-reagenssien ominaisuudet
Antifade-reagenssi
p-fenyleeni –
diamiini
tehokkain reagenssi FITC: lle. Tehokas myös Rodamiinille. Annostuksen tulee olla 0, 1% p-fenyleenidiamiinia glyserolissa/PBS käytettäväksi. Reagenssi mustuu valolle altistuessaan, joten sitä on säilytettävä pimeässä. Ihokosketus on erittäin vaarallista.
DABCO
(1,4-diatsabi-
syklo-2,2,2 –
oktaani)
erittäin tehokas FITC: lle. Vaikka sen vaikutus on hieman pienempi kuin p-fenyleenidiamiinin, se kestää paremmin valoa ja sillä on korkeampi turvallisuustaso.
n-propyyligallaatti tehokkain reagenssi Rodamiinille, myös tehokas FITC: lle. 1% propyyligallaattia glyserolissa/PBS: ssä käytettäväksi.
2-merkapto –
etyyliamiini
käytetään propidiumjodidilla, akridiinioranssilla tai Kromomysiini A3: lla värjättyjen kromosomi-ja DNA-näytteiden havainnointiin. On säädettävä 0, 1 mM 2-merkaptoyyliamiiniin Tris-EDTA: ssa
Taulukko 2

joissakin näytteissä haalistumisasteen vähentämiseksi voi olla suositeltavaa käyttää neutraalia tiheyssuodatinta valoradalla ennen kuin Valaistus saavuttaa herätesuodattimen, mikä vähentää herätevalon voimakkuutta. Muissa tapauksissa haalistumisvaikutuksia voidaan vähentää muuttamalla kiinnitysaineen pH: ta tai käyttämällä valkaisuaineita (Useita tärkeämpiä aineita on lueteltu taulukossa 2). Digitaalisen kuvantamisen, fotomikrografia, tai yksinkertaisesti visuaalinen havainto, nopeasti muuttuva näkökenttä voi myös välttää haalistumista vaikutuksia.

Myötävaikuttavat Tekijät

Mortimer Abramowitz – Olympus America, Inc., Two Corporate Center Drive., Melville, New York, 11747.

Michael W. Davidson-National High Magnetic Field Laboratory, 1800 East Paul Dirac Dr., Florida State University, Tallahassee, Florida, 32310.

Vastaa

Sähköpostiosoitettasi ei julkaista.