En raison de leurs nouvelles configurations électroniques, les fluorochromes ont des spectres uniques et caractéristiques d’absorption (généralement similaires à l’excitation) et d’émission. Ces spectres d’absorption et d’émission montrent une intensité relative de fluorescence, l’intensité relative étant tracée classiquement sur l’axe vertical par rapport à la longueur d’onde sur l’axe horizontal. Pour un fluorochrome donné, les fabricants indiquent la longueur d’onde pour le pic de l’intensité d’excitation d’éclairement et la longueur d’onde pour le pic de l’intensité d’émission de fluorescence. Il est important de comprendre l’origine des graphes et courbes affichant les spectres d’excitation et d’émission pour un fluorochrome donné.

Afin de déterminer le spectre d’émission d’un fluorochrome particulier, la longueur d’onde d’absorption maximale (généralement la même que le maximum d’excitation) est déterminée et le fluorochrome est excité à cette longueur d’onde. Le spectre d’absorption d’un fluorochrome typique est illustré à la figure 1(a) où l’intensité relative d’absorption est représentée par rapport à la longueur d’onde mesurée. Un monochromateur (un dispositif qui laisse passer des bandes étroites de longueurs d’onde lumineuses) est ensuite utilisé pour balayer l’intensité d’émission de fluorescence sur toute la série de longueurs d’onde d’émission. L’intensité relative de la fluorescence est mesurée aux différentes longueurs d’onde pour tracer le spectre d’émission, comme illustré à la figure 1(b). Le spectre d’excitation d’un fluorochrome donné est déterminé de manière similaire en surveillant l’émission de fluorescence à la longueur d’onde d’intensité maximale tandis que le fluorophore est excité à travers un groupe de longueurs d’onde consécutives. Le maximum d’émission est choisi et seule la lumière d’émission à cette longueur d’onde est autorisée à passer au détecteur. L’excitation est induite (généralement au moyen d’un monochromateur) à différentes longueurs d’onde d’excitation et l’intensité de la fluorescence émise est mesurée en fonction de la longueur d’onde. Le résultat est un graphique ou une courbe (illustré à la figure 1(a)), qui représente l’intensité relative de fluorescence produite par l’excitation sur le spectre des longueurs d’onde d’excitation.

Spectres de filtre de fluorescence

Explorez les régions de chevauchement des profils spectraux d’excitation, d’émission et de filtre dichromatique de fluorescence et comment les changements dans les caractéristiques de transmission déterminent la largeur de bande des longueurs d’onde traversées par diverses combinaisons de filtres.

Plusieurs observations peuvent être faites à partir d’un ensemble typique de courbes ou de spectres d’excitation et d’émission. Il y a généralement un chevauchement entre l’extrémité de longueur d’onde supérieure du spectre d’excitation et l’extrémité de longueur d’onde inférieure du spectre d’émission. Ce chevauchement des intensités et des longueurs d’onde d’excitation et d’émission (illustré à la figure 1(c)) doit être éliminé, en microscopie à fluorescence, au moyen de la sélection appropriée pour un filtre d’excitation, un séparateur de faisceau dichromatique (en fluorescence réfléchie) et un filtre barrière ou d’émission. Sinon, la lumière d’excitation beaucoup plus brillante submerge la lumière de fluorescence émise plus faible et diminue considérablement le contraste de l’échantillon.

Lorsque les électrons passent de l’état excité à l’état fondamental (voir la section ci-dessous intitulée Explication moléculaire), il y a une perte d’énergie vibratoire. En conséquence, le spectre d’émission est déplacé vers des longueurs d’onde plus longues que le spectre d’excitation (la longueur d’onde varie inversement à l’énergie de rayonnement). Ce phénomène est connu sous le nom de loi de Stokes ou décalage de Stokes. Plus le décalage de Stokes est important, plus il est facile de séparer la lumière d’excitation de la lumière d’émission. Le pic d’intensité d’émission est généralement inférieur au pic d’excitation, et la courbe d’émission est souvent une image miroir de la courbe d’excitation, mais décalée vers des longueurs d’onde plus longues. Pour atteindre une intensité de fluorescence maximale, le fluorochrome est généralement excité à la longueur d’onde au pic de la courbe d’excitation, et la détection d’émission est sélectionnée à la longueur d’onde crête (ou à d’autres longueurs d’onde choisies par l’observateur) de la courbe d’émission. Les sélections des longueurs d’onde d’excitation et des longueurs d’onde d’émission sont contrôlées par des filtres appropriés. Pour déterminer la réponse spectrale d’un système optique, des corrections techniques sont nécessaires pour prendre en compte des facteurs tels que la transmission du verre et les variables de sensibilité du détecteur pour différentes longueurs d’onde.

Un diagramme spectral d’absorption-émission de fluorochromes typique est illustré à la figure 2. Notez que les courbes d’intensité de fluorescence pour l’absorption (généralement similaires à la courbe d’excitation pour les composés purs) et d’émission pour ce fluorochrome typique sont de forme quelque peu similaire. Le décalage de longueur d’onde entre l’excitation et l’émission est connu depuis le milieu du XIXe siècle (loi de Stokes). Notez également que les courbes d’excitation et d’émission se chevauchent quelque peu à l’extrémité supérieure de l’excitation et aux longueurs d’onde inférieures de la courbe d’émission.

Cubes de filtres à fluorescence

Découvrez comment les variations de la région de longueur d’onde passe-bande des filtres d’excitation et de barrière permettent à une bande de longueurs d’onde spécifique d’éclairer l’échantillon, puis de passer au détecteur tandis que toutes les autres sont exclues.

La séparation des longueurs d’onde d’excitation et d’émission est obtenue par la sélection appropriée de filtres pour bloquer ou passer des longueurs d’onde spécifiques du spectre, comme présenté à la figure 3. La conception des illuminateurs à fluorescence est basée sur le contrôle de la lumière d’excitation et de la lumière d’émission par des insertions de filtres facilement modifiables dans le trajet de la lumière vers l’échantillon, puis émanant de l’échantillon. Il est important, compte tenu des faibles intensités d’émission, que la source lumineuse choisie pour l’excitation soit d’une luminosité suffisante pour que la lumière d’émission relativement faible puisse être maximisée, et que des fluorochromes d’absorption et de rendement satisfaisants soient choisis.

L’efficacité avec laquelle le fluorochrome absorbe la lumière d’excitation est connue sous le nom de coefficient d’extinction. Plus le coefficient d’extinction est élevé, plus la possibilité d’absorption de la lumière dans une région de longueur d’onde donnée est grande (condition préalable à l’émission de fluorescence qui s’ensuit). Le rendement de la lumière émise est appelé rendement quantique, le rapport du nombre de quanta (« paquets » d’énergie) émis par rapport au nombre de quanta absorbés (généralement le rendement est compris entre 0,1 et 0,9). Les rendements quantiques inférieurs à 1 sont le résultat de la perte d’énergie par des voies non radiatives (telles que la chaleur ou une réaction photochimique) plutôt que par la voie radiative de fluorescence. Les rendements quantiques de fluorescence pour un groupe de fluorochromes sélectionnés sont énumérés ci-dessous dans le tableau 1. Notez que certains rendements quantiques semblent triviaux (benzène) tandis que d’autres sont très efficaces (Fluorescéine et Rhodamine-B).

Rendements Quantiques de fluorescence Fluorochrome
Composé Solvant Excitation
Longueur d’onde
(nm)
Émission
Longueur d’onde
(nm)
Rendement quantique
Orange Acridine Éthanol 493 535 0.46
Benzène Éthanol 248 300-350 0.04
Chlorophylle – A Éthanol 440 685 0.23
Éosine Eau 521 544 0.16
Fluorescéine Eau 437 515 0.92
Rhodamine-B Éthanol 555 627 0.97
Tableau 1

Le coefficient d’extinction, le rendement quantique, l’intensité lumineuse moyenne de la source lumineuse et la durée de vie de la fluorescence sont tous des facteurs importants contribuant à l’intensité et à l’utilité de l’émission de fluorescence. De plus, l’environnement localisé entourant le fluorochrome joue un rôle primordial dans la détermination des caractéristiques de l’émission de fluorescence. Des variables telles que la viscosité du solvant, les concentrations ioniques, le pH et l’hydrophobicité dans l’environnement peuvent avoir des effets profonds sur l’intensité de fluorescence et la durée de vie de l’état excité.

Explication moléculaire de la fluorescence

L’activité de fluorescence est parfois représentée schématiquement comme le montre la Figure 4 (a) (appelée diagramme d’énergie de Jablonski). Avant l’excitation, la configuration électronique de la molécule est décrite comme étant à l’état fondamental. Lors de l’absorption d’un photon de lumière d’excitation, généralement de courtes longueurs d’onde, les électrons peuvent être élevés à une énergie et à un état excité vibrationnel plus élevés, un processus qui ne peut prendre qu’un quadrillionième de seconde (une période de temps communément appelée femtoseconde, 10E-15 secondes).

En fluorescence, pendant un intervalle d’environ un trillionième de seconde (une picoseconde ou 10E-12 secondes), les électrons excités peuvent perdre de l’énergie vibratoire au milieu environnant et revenir à ce qu’on appelle l’état singulet excité le plus bas. À partir de l’état singulet excité le plus bas, les électrons sont alors capables de « se détendre » à l’état fondamental avec émission simultanée de lumière fluorescente comme illustré à la figure 4 (a). La lumière émise est toujours de longueur d’onde plus longue que la lumière d’excitation (loi de Stokes) et continue tant que l’éclairage d’excitation baigne l’échantillon fluorescent. Si le rayonnement d’excitation est arrêté, la fluorescence cesse.

Diagramme d’énergie de Jablonski

Explorez comment un électron absorbe de l’énergie et transcende à un état d’énergie plus élevé selon un diagramme de niveau d’énergie de Jablonski. Une fois qu’un électron est à l’état excité, il se détend lentement par des effets vibratoires et peut ensuite retomber à l’état fondamental en émettant un photon (fluorescence).

De temps en temps, les électrons excités, au lieu de se détendre à l’état singulet le plus bas par des interactions vibratoires, effectuent une transition interdite vers l’état triplet sortant, puis vers l’état fondamental dans un processus où l’émission de rayonnement peut être considérablement retardée – jusqu’à plusieurs secondes ou plus. Ce phénomène est caractéristique de la phosphorescence, comme le montre la figure 4(b). Dans certains cas, les électrons excités peuvent passer de l’état triplet à l’état singulet excité le plus bas, puis revenir à l’état fondamental, émettant ensuite une lumière fluorescente. Cette action prend un peu plus de temps (environ une microseconde ou deux) que la fluorescence habituelle et est appelée fluorescence retardée (Figure 4 (c)). Dans d’autres circonstances (par exemple, le photoblanchiment ou la présence de sels de métaux lourds ou d’autres produits chimiques), la lumière émise peut être considérablement réduite ou complètement arrêtée, comme indiqué ci-dessous.

Décoloration ou photoblanchiment

Certaines conditions spécifiques peuvent affecter le re-rayonnement de la lumière par un fluorophore excité, et ainsi réduire l’intensité de la fluorescence. Cette réduction de l’intensité d’émission est généralement appelée décoloration ou photoblanchiment. Certains auteurs subdivisent en outre la décoloration en trempe et blanchiment. Le blanchiment est une décomposition irréversible des molécules fluorescentes en raison de l’intensité lumineuse en présence d’oxygène moléculaire. La trempe entraîne également une intensité de fluorescence réduite et est fréquemment provoquée par des agents oxydants ou la présence de sels de métaux lourds ou de composés halogénés.

Souvent, la trempe résulte du transfert d’énergie vers d’autres molécules acceptrices physiquement proches des fluorophores excités, un phénomène connu sous le nom de transfert d’énergie par résonance. Ce phénomène particulier est devenu la base d’une technique plus récente de mesure de distances très inférieures à la résolution latérale du microscope optique.

L’apparition du blanchiment a conduit à une technique connue sous le nom de FRAP, ou récupération par fluorescence après photoblanchiment. FRAP est basé sur le blanchiment par de courtes rafales laser et l’observation ultérieure de la récupération de la fluorescence causée par la diffusion de fluorophores dans la zone blanchie.

Propriétés des réactifs Antifades populaires
Réactif Antifade
p-phénylène –
diamine
Le réactif le plus efficace pour le FITC. Également efficace pour la rhodamine. Devrait être ajusté à 0,1% de p-phénylènediamine dans le glycérol / PBS pour l’utilisation. Le réactif noircit lorsqu’il est exposé à la lumière, il doit donc être stocké dans un endroit sombre. Le contact avec la peau est extrêmement dangereux.
DABCO
(1,4-diazabi-
cyclo-2,2,2-
octane)
Très efficace pour le FITC. Bien que son effet soit légèrement inférieur à celui de la p-phénylènediamine, il est plus résistant à la lumière et présente un niveau de sécurité plus élevé.
n-propylgallate Le réactif le plus efficace pour la rhodamine, également efficace pour le FITC. Doit être ajusté à 1% de propylgallate dans le glycérol / PBS pour l’utilisation.
2- mercapto-
éthylamine
Utilisée pour observer des échantillons de chromosomes et d’ADN colorés à l’iodure de propidium, à l’orange acridine ou à la chromomysine A3. Doit être ajusté à 0,1 mM de 2-mercaptotheylamine dans le Tris-EDTA
Tableau 2

Pour réduire le degré de décoloration de certains échantillons, il peut être conseillé d’utiliser un filtre de densité neutre dans le trajet lumineux avant que l’éclairage n’atteigne le filtre d’excitation, diminuant ainsi l’intensité lumineuse d’excitation. Dans d’autres cas, les effets de décoloration peuvent être réduits en modifiant le pH du milieu de montage ou en utilisant des agents anti-blanchiment (plusieurs des agents les plus importants sont répertoriés dans le tableau 2). Pour l’imagerie numérique, la photomicrographie ou simplement l’observation visuelle, une modification rapide du champ de vision peut également éviter les effets de décoloration.

Auteurs contributeurs

Mortimer Abramowitz – Olympus America, Inc., Deux Lecteur de Centre d’entreprise., Melville, New York, 11747.

Michael W. Davidson – Laboratoire National de Champ Magnétique Élevé, 1800 Est Paul Dirac Dr., L’Université d’État de Floride, Tallahassee, Floride, 32310.

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