új elektronikus konfigurációik miatt a fluorokrómok egyedi és jellegzetes spektrumokkal rendelkeznek az abszorpcióhoz (általában a gerjesztéshez hasonlóan) és az emisszióhoz. Ezek az abszorpciós és emissziós spektrumok a fluoreszcencia relatív intenzitását mutatják, a relatív intenzitást klasszikusan ábrázolva a függőleges tengelyen a vízszintes tengely hullámhosszával szemben. Egy adott fluorokróm esetében a gyártók megadják a megvilágítási gerjesztési intenzitás csúcsának hullámhosszát, a fluoreszcencia emissziós intenzitás csúcsának hullámhosszát. Fontos megérteni az adott fluorokróm gerjesztési és emissziós spektrumát megjelenítő grafikonok és görbék eredetét.

egy adott fluorokróm emissziós spektrumának meghatározásához meghatározzuk a maximális abszorpció hullámhosszát (általában megegyezik a gerjesztési maximummal), és ezen a hullámhosszon gerjesztjük a fluorokrómot. Egy tipikus fluorokróm abszorpciós spektrumát az 1. A) ábra szemlélteti, ahol az abszorpció relatív intenzitását ábrázoljuk a mért hullámhosszhoz viszonyítva. A monokromator (olyan eszköz, amely lehetővé teszi a keskeny fényhullám-sávok áthaladását) ezután a fluoreszcencia emisszió intenzitásának beolvasására szolgál az emissziós hullámhossz teljes sorozatán. A fluoreszcencia relatív intenzitását a különböző hullámhosszokon mérjük az emissziós spektrum ábrázolásához, amint azt az 1(b) ábra szemlélteti. Egy adott fluorokróm gerjesztési spektrumát hasonló módon határozzuk meg a fluoreszcencia emisszió monitorozásával a maximális intenzitás hullámhosszán, miközben a fluorofor egy csoport egymást követő hullámhosszon keresztül gerjesztődik. Kiválasztják a maximális kibocsátási értéket, és csak az adott hullámhosszon lévő emissziós fény juthat át a detektorba. A gerjesztést (általában monokromátor segítségével) különböző gerjesztési hullámhosszokon indukálják, és a kibocsátott fluoreszcencia intenzitását a hullámhossz függvényében mérik. Az eredmény egy grafikon vagy görbe (az 1(a) ábrán szemléltetve), amely a gerjesztés által a gerjesztési hullámhosszok spektrumán előállított relatív fluoreszcencia intenzitást ábrázolja.

fluoreszcencia szűrő spektrumok

fedezze fel a fluoreszcencia gerjesztés, emisszió és dikromatikus szűrő spektrális profilok átfedési régióit, és hogyan határozzák meg az átviteli jellemzők változásai a különböző szűrőkombinációkon áthaladó hullámhosszak sávszélességét.

számos megfigyelés elvégezhető egy tipikus gerjesztési és emissziós görbék vagy spektrumok halmazából. Általában átfedés van a gerjesztési spektrum magasabb hullámhosszú vége és az emissziós spektrum alacsonyabb hullámhosszú vége között. A gerjesztés és az emissziós intenzitás és hullámhossz átfedését (az 1.c) ábra szemlélteti) fluoreszcens mikroszkópos vizsgálat során a gerjesztő szűrő, a dikromatikus sugárelosztó(a visszavert fény fluoreszcenciájában) és a barrier vagy emissziós szűrő megfelelő kiválasztásával meg kell szüntetni. Ellenkező esetben a sokkal fényesebb gerjesztő fény elnyomja a gyengébb kibocsátott fluoreszcens fényt, és jelentősen csökkenti a minta kontrasztját.

amikor az elektronok a gerjesztett állapotból az alapállapotba kerülnek (lásd az alábbi szakaszt molekuláris magyarázat), a rezgési energia csökken. Ennek eredményeként az emissziós spektrum hosszabb hullámhosszra tolódik, mint a gerjesztési spektrum (a hullámhossz fordítottan változik a sugárzási energiától). Ezt a jelenséget Stokes-törvénynek vagy Stokes-váltásnak nevezik. Minél nagyobb a Stokes eltolódás, annál könnyebb elválasztani a gerjesztő fényt az emissziós fénytől. Az emissziós intenzitás csúcsa általában alacsonyabb, mint a gerjesztési csúcs, és az emissziós görbe gyakran a gerjesztési görbe tükörképe, de hosszabb hullámhosszra tolódik. A maximális fluoreszcencia intenzitás elérése érdekében a fluorokrómot általában a gerjesztési görbe csúcsán lévő hullámhosszon gerjesztik, az emisszió detektálását pedig az emissziós Görbe csúcs hullámhosszán (vagy a megfigyelő által választott más hullámhosszon) választják meg. A gerjesztési hullámhossz és az emissziós hullámhossz kiválasztását megfelelő szűrők szabályozzák. Az optikai rendszer spektrális válaszának meghatározásakor technikai korrekciókra van szükség olyan tényezők figyelembevétele érdekében, mint az üvegátvitel és a detektor érzékenységi változói a különböző hullámhosszokon.

a tipikus fluorokróm abszorpciós-emissziós spektrális diagramot a 2. ábra szemlélteti. Megjegyezzük, hogy a fluoreszcencia intenzitásának görbéi az abszorpcióhoz (általában hasonlóak a tiszta vegyületek gerjesztési görbéjéhez) és az emisszió ehhez a tipikus fluorokrómhoz kissé hasonló alakúak. A gerjesztés és az emisszió közötti hullámhossz-eltolódás a tizenkilencedik század közepe óta ismert (Stokes-törvény). Azt is meg kell jegyezni, hogy a gerjesztési és emissziós görbék kissé átfedik egymást a gerjesztés felső végén és az emissziós görbe alsó hullámhosszain.

fluoreszcens Szűrőkockák

fedezze fel, hogy a gerjesztés és a gátszűrők sáváteresztő hullámhossz-tartományának variációi lehetővé teszik, hogy egy adott hullámhossz-sáv megvilágítsa a mintát, majd áthaladjon a detektoron, miközben az összes többi ki van zárva.

a gerjesztési és emissziós hullámhosszak szétválasztását a spektrum meghatározott hullámhosszainak blokkolására vagy áthaladására szolgáló szűrők megfelelő kiválasztásával lehet elérni, amint azt a 3.ábra mutatja. A fluoreszcens megvilágítók kialakítása a gerjesztő fény és az emissziós fény szabályozásán alapul, könnyen cserélhető szűrőbetétekkel a fényútba a minta felé vezető úton, majd a mintából kiindulva. Az alacsony emissziós intenzitásokra való tekintettel fontos, hogy a gerjesztésre kiválasztott fényforrás elegendő fényerővel rendelkezzen ahhoz, hogy a viszonylag gyenge emissziós fény maximalizálható legyen, és hogy kielégítő abszorpciós és hozamú fluorokrómokat válasszanak.

azt a hatékonyságot, amellyel a fluorokróm elnyeli a gerjesztő fényt, kihalási együtthatónak nevezzük. Minél nagyobb a kihalási együttható, annál nagyobb a fényelnyelés lehetősége egy adott hullámhossz-régióban (a következő fluoreszcencia-emisszió előfeltétele). A kibocsátott fény hozamát kvantumhozamnak nevezzük, amely a kibocsátott kvantumok (“energiacsomagok”) számának aránya az elnyelt kvantumok számához képest (általában a hozam 0,1-0,9 között van). Az 1 alatti kvantumhozamok a nem sugárzó utak (például hő vagy fotokémiai reakció) révén bekövetkező energiaveszteség következményei, nem pedig a fluoreszcencia újbóli sugárzási útja. Az alábbiakban az 1. táblázat sorolja fel a kiválasztott fluorokrómok csoportjának fluoreszcencia kvantumhozamait. Figyeljük meg, hogy egyes kvantumhozamok triviálisnak tűnnek (benzol), míg mások nagyon hatékonyak (fluoreszcein és rodamin-B).

Fluorokróm fluoreszcencia Kvantumhozamok
vegyület oldószer gerjesztés
hullámhossz
(nm)
emisszió
hullámhossz
(nm)
Kvantumhozam
akridin Narancs etanol 493 535 0.46
benzol etanol 248 300-350 0.04
Klorofill-A Etanol 440 685 0.23
Eozin Víz 521 544 0.16
Fluoreszcein Víz 437 515 0.92
Rodamin-B Etanol 555 627 0.97
táblázat 1

a kihalási együttható, a kvantumhozam, a fényforrás átlagos fényintenzitása és a fluoreszcencia élettartama mind fontos tényezők, amelyek hozzájárulnak a fluoreszcencia emisszió intenzitásához és hasznosságához. Ezenkívül a fluorokrómot körülvevő lokalizált környezet kiemelkedő szerepet játszik a fluoreszcencia emisszió jellemzőinek meghatározásában. Az olyan változók, mint az oldószer viszkozitása, az ionkoncentrációk, a pH és a hidrofób hatás a környezetben mély hatást gyakorolhatnak mind a fluoreszcencia intenzitására, mind a gerjesztett állapot élettartamára.

a fluoreszcencia molekuláris magyarázata

a fluoreszcencia aktivitást néha vázlatosan ábrázolják, amint azt a 4(a) ábra mutatja (Jablonski energiadiagramnak nevezik). A gerjesztés előtt a molekula elektronikus konfigurációját úgy írják le, hogy alapállapotban van. Amikor elnyeli a gerjesztési fény fotonját, általában rövid hullámhosszú, az elektronok magasabb energiára és vibrációs gerjesztett állapotba emelhetők, ez a folyamat csak a másodperc négymilliárdod részét veheti igénybe (ezt az időszakot általában femtoszekundumnak, 10E-15 másodpercnek nevezik).

a fluoreszcencia során körülbelül egy másodperc trilliomod része (pikoszekundum vagy 10E-12 másodperc) alatt a gerjesztett elektronok elveszíthetnek némi vibrációs energiát a környező környezetbe, és visszatérhetnek az úgynevezett legalacsonyabb gerjesztett szingulett állapotba. A legalacsonyabb gerjesztett szingulett állapotból az elektronok képesek” ellazulni ” az alapállapotba a fluoreszcens fény egyidejű kibocsátásával, amint azt a 4(a) ábra szemlélteti. A kibocsátott fény mindig hosszabb hullámhosszú, mint a gerjesztő fény (Stokes-törvény), és addig folytatódik, amíg a gerjesztő megvilágítás fürdeti a fluoreszkáló mintát. Ha az izgalmas sugárzás leáll, a fluoreszcencia megszűnik.

Jablonski energia Diagram

fedezze fel, hogy egy elektron hogyan nyeli el az energiát és lép át egy magasabb energiaállapotba egy Jablonski energiaszint diagram szerint. Amint egy elektron gerjesztett állapotban van, vibrációs hatások révén lassan ellazul, majd foton kibocsátásával (fluoreszcencia) visszaeshet az alapállapotba.

alkalmanként a gerjesztett elektronok ahelyett, hogy rezgési kölcsönhatások révén a legalacsonyabb szingulett állapotba lazulnának, tiltott átmenetet hajtanak végre a kilépett hármasállapotba, majd az alapállapotba egy olyan folyamatban, ahol a sugárzás kibocsátása jelentősen késleltethető-akár több másodpercig is. Ez a jelenség a foszforeszcenciára jellemző, amint azt a 4(b) ábra mutatja. Bizonyos esetekben a gerjesztett elektronok a hármas állapotból visszatérhetnek a legalacsonyabb gerjesztett szingulett állapotba, majd visszatérhetnek az alapállapotba, ezt követően fluoreszkáló fényt bocsátanak ki. Ez a művelet egy kicsit hosszabb ideig tart (körülbelül egy mikroszekundum vagy kettő), mint a szokásos fluoreszcencia, és késleltetett fluoreszcenciának nevezik(4 (c) ábra). Más körülmények között (például fényfehérítés vagy nehézfémek vagy más vegyi anyagok sóinak jelenléte) a kibocsátott fény jelentősen csökkenthető vagy teljesen leállítható, amint azt az alábbiakban tárgyaljuk.

Fading vagy fotobleaching

vannak olyan speciális körülmények, amelyek befolyásolhatják a gerjesztett fluorofor által a fény újbóli sugárzását, és ezáltal csökkenthetik a fluoreszcencia intenzitását. Az emisszió intenzitásának ezt a csökkentését általában fakulásnak vagy fényfehérítésnek nevezik. Egyes szerzők tovább osztják a fakulást oltásra és fehérítésre. A fehérítés a fluoreszcens molekulák visszafordíthatatlan bomlása a fényintenzitás miatt molekuláris oxigén jelenlétében. A kioltás a fluoreszcencia intenzitásának csökkenését is eredményezi, és gyakran oxidálószerek vagy nehézfémek vagy halogénvegyületek sóinak jelenléte következtében alakul ki.

a kioltás gyakran az energia átviteléből származik más akceptor molekulákba, amelyek fizikailag közel vannak a gerjesztett fluoroforokhoz, ezt a jelenséget rezonancia energiaátadásnak nevezik. Ez a jelenség a fénymikroszkóp oldalirányú felbontása alatti távolságok mérésének újabb technikájának alapjává vált.

a fehérítés előfordulása a Frap néven ismert technikához vezetett, vagy fluoreszcencia helyreállítás fotobleaching után. A FRAP rövid lézeres kitörésekkel történő fehérítésen, majd a fluoroforok fehérített területre történő diffúziója által okozott fluoreszcencia helyreállításának későbbi megfigyelésén alapul.

a népszerű Antifade reagensek tulajdonságai
Antifade reagens
p-fenilén –
diamin
a fitc leghatékonyabb reagense. A rodamin esetében is hatékony. A glicerin/PBS-ben 0,1% p-fenilén-diaminra kell beállítani. A reagens elsötétül, ha fénynek van kitéve, ezért sötét helyen kell tárolni. A bőrrel való érintkezés rendkívül veszélyes.
DABCO
(1,4-diazabi-
ciklo-2,2,2 –
oktán)
nagyon hatékony a FITC számára. Bár hatása valamivel alacsonyabb, mint a p-feniléndiaminé, jobban ellenáll a fénynek és magasabb szintű biztonságot nyújt.
n-propilgallát a rodamin leghatékonyabb reagense, amely fitc-re is hatékony. A glicerin/PBS-ben lévő propilgallátot 1% – ra kell beállítani.
2-merkapto –
etilamin
propidium-jodiddal, akridin-narancssárgával vagy Kromomizin A3-Mal festett kromoszóma-és DNS-minták megfigyelésére használják. A Tris-EDTA-ban 0,1 mM-es 2-merkaptoteilaminra kell beállítani
táblázat 2

egyes mintákban a fakulás mértékének csökkentése érdekében célszerű lehet semleges sűrűségű szűrőt használni a fényútban, mielőtt a megvilágítás eléri a gerjesztő szűrőt, ezáltal csökkentve a gerjesztő fény intenzitását. Más esetekben a fading hatások csökkenthetők a szerelőközeg pH-jának megváltoztatásával vagy fehérítőszerek alkalmazásával (a fontosabb szerek közül többet a 2.táblázat sorol fel). Digitális képalkotáshoz, fotomikrográfiához vagy egyszerűen vizuális megfigyeléshez a látómező gyors megváltoztatása szintén elkerülheti a halványuló hatásokat.

Közreműködő Szerzők

Mortimer Abramowitz – Olympus America, Inc., Két Vállalati Központ Meghajtó., Melville, New York, 11747.

Michael W. Davidson – Országos Magas Mágneses Mező Laboratórium, 1800 East Paul Dirac Dr., A Floridai Állami Egyetem, Tallahassee, Florida, 32310.

Vélemény, hozzászólás?

Az e-mail-címet nem tesszük közzé.