A causa delle loro nuove configurazioni elettroniche, i fluorocromi hanno spettri unici e caratteristici per l’assorbimento (di solito simili all’eccitazione) e l’emissione. Questi spettri di assorbimento ed emissione mostrano l’intensità relativa della fluorescenza, con l’intensità relativa classicamente tracciata sull’asse verticale rispetto alla lunghezza d’onda sull’asse orizzontale. Per un determinato fluorocromo, i produttori indicano la lunghezza d’onda per il picco dell’intensità di eccitazione dell’illuminazione e la lunghezza d’onda per il picco dell’intensità dell’emissione di fluorescenza. È importante comprendere l’origine dei grafici e delle curve che mostrano gli spettri di eccitazione ed emissione per un determinato fluorocromo.

Per determinare lo spettro di emissione di un particolare fluorocromo, viene determinata la lunghezza d’onda di massimo assorbimento (di solito uguale al massimo di eccitazione) e il fluorocromo viene eccitato a quella lunghezza d’onda. Lo spettro di assorbimento di un fluorocromo tipico è illustrato nella Figura 1 (a) dove l’intensità relativa di assorbimento è tracciata contro la lunghezza d’onda misurata. Un monocromatore (un dispositivo che consente il passaggio di bande strette di lunghezze d’onda della luce) viene quindi utilizzato per scansionare l’intensità dell’emissione di fluorescenza sull’intera serie di lunghezze d’onda di emissione. L’intensità relativa della fluorescenza è misurata alle varie lunghezze d’onda per tracciare lo spettro di emissione, come illustrato nella Figura 1(b). Lo spettro di eccitazione di un determinato fluorocromo è determinato in modo simile monitorando l’emissione di fluorescenza alla lunghezza d’onda di massima intensità mentre il fluoroforo è eccitato attraverso un gruppo di lunghezze d’onda consecutive. Viene scelto il massimo di emissione e solo la luce di emissione a quella lunghezza d’onda può passare al rivelatore. L’eccitazione è indotta (solitamente per mezzo di un monocromatore) a varie lunghezze d’onda di eccitazione e l’intensità della fluorescenza emessa viene misurata in funzione della lunghezza d’onda. Il risultato è un grafico o una curva (illustrata nella Figura 1 (a)), che descrive l’intensità relativa di fluorescenza prodotta dall’eccitazione sullo spettro delle lunghezze d’onda di eccitazione.

Spettri del filtro a fluorescenza

Esplora le regioni di sovrapposizione dei profili spettrali di eccitazione, emissione e filtro dicromatico della fluorescenza e come i cambiamenti nelle caratteristiche di trasmissione determinano la larghezza di banda delle lunghezze d’onda passate attraverso varie combinazioni di filtri.

Diverse osservazioni possono essere fatte da un tipico insieme di curve o spettri di eccitazione ed emissione. C’è solitamente una sovrapposizione fra l’estremità più alta di lunghezza d’onda dello spettro di eccitazione e l’estremità più bassa di lunghezza d’onda dello spettro dell’emissione. Questa sovrapposizione di intensità di eccitazione e di emissione e lunghezze d’onda (illustrate nella figura 1(c)) deve essere eliminata, in microscopia a fluorescenza, mediante la selezione appropriata per un filtro di eccitazione, un beamsplitter dicromatico (in fluorescenza a luce riflessa) e un filtro di barriera o di emissione. Altrimenti, la luce di eccitazione molto più luminosa travolge la luce di fluorescenza emessa più debole e diminuisce significativamente il contrasto del campione.

Quando gli elettroni passano dallo stato eccitato allo stato fondamentale (vedi la sezione sotto intitolata Spiegazione molecolare), c’è una perdita di energia vibrazionale. Di conseguenza, lo spettro di emissione viene spostato a lunghezze d’onda più lunghe rispetto allo spettro di eccitazione (la lunghezza d’onda varia inversamente all’energia della radiazione). Questo fenomeno è noto come legge di Stokes o Stokes shift. Maggiore è lo spostamento di Stokes, più facile è separare la luce di eccitazione dalla luce di emissione. Il picco di intensità di emissione è solitamente inferiore al picco di eccitazione e la curva di emissione è spesso un’immagine speculare della curva di eccitazione, ma spostata su lunghezze d’onda più lunghe. Al fine di ottenere la massima intensità di fluorescenza, il fluorocromo viene solitamente eccitato alla lunghezza d’onda al picco della curva di eccitazione e il rilevamento delle emissioni viene selezionato alla lunghezza d’onda di picco (o altre lunghezze d’onda scelte dall’osservatore) della curva di emissione. Le selezioni delle lunghezze d’onda di eccitazione e delle lunghezze d’onda di emissione sono controllate da filtri appropriati. Nel determinare la risposta spettrale di un sistema ottico, sono necessarie correzioni tecniche per tenere conto di fattori quali la trasmissione del vetro e le variabili di sensibilità del rivelatore per diverse lunghezze d’onda.

Un tipico diagramma spettrale di assorbimento-emissione del fluorocromo è illustrato nella Figura 2. Si noti che le curve di intensità della fluorescenza per l’assorbimento (di solito simili alla curva di eccitazione per i composti puri) e l’emissione per questo tipico fluorocromo sono in qualche modo simili nella forma. Lo spostamento della lunghezza d’onda tra eccitazione ed emissione è noto dalla metà del diciannovesimo secolo (Legge di Stokes). Si noti inoltre che le curve di eccitazione e di emissione si sovrappongono leggermente all’estremità superiore dell’eccitazione e alle lunghezze d’onda inferiori della curva di emissione.

Cubi di filtro a fluorescenza

Scopri come le variazioni nella regione di lunghezza d’onda passa banda dei filtri di eccitazione e barriera consentono a una specifica banda di lunghezze d’onda di illuminare il campione e quindi passare attraverso il rivelatore mentre tutti gli altri sono esclusi.

La separazione delle lunghezze d’onda di eccitazione e di emissione è ottenuta mediante la corretta selezione di filtri per bloccare o passare specifiche lunghezze d’onda dello spettro come presentato in Figura 3. Il design degli illuminatori a fluorescenza si basa sul controllo della luce di eccitazione e della luce di emissione mediante inserimenti di filtri facilmente modificabili nel percorso della luce sulla strada verso il campione e quindi proveniente dal campione. È importante, in considerazione delle basse intensità di emissione, che la sorgente luminosa scelta per l’eccitazione sia di luminosità sufficiente in modo che la luce di emissione relativamente debole possa essere massimizzata e che siano scelti fluorocromi di assorbimento e resa soddisfacenti.

L’efficienza con cui il fluorocromo assorbe la luce di eccitazione è nota come coefficiente di estinzione. Maggiore è il coefficiente di estinzione, maggiore è la possibilità di assorbimento della luce in una data regione di lunghezza d’onda (un prerequisito per la conseguente emissione di fluorescenza). La resa della luce emessa è indicata come la resa quantistica, il rapporto tra il numero di quanti (“pacchetti” di energia) emessi rispetto al numero di quanti assorbiti (di solito la resa è compresa tra 0,1 e 0,9). Le rese quantistiche inferiori a 1 sono il risultato della perdita di energia attraverso vie non radiative (come il calore o una reazione fotochimica) piuttosto che la via ri-radiativa della fluorescenza. Elencati di seguito nella Tabella 1 sono i rendimenti quantici di fluorescenza per un gruppo di fluorocromi selezionati. Si noti che alcuni rendimenti quantistici sembrano banali (benzene) mentre altri sono molto efficienti (fluoresceina e rodamina-B).

Fluorocromo di Fluorescenza di Quantum
Composto Solvente Eccitazione
lunghezza d’Onda
(nm)
Emissione
lunghezza d’Onda
(nm)
Rendimento Quantico
Arancio di Acridina Etanolo 493 535 0.46
Benzene Etanolo 248 300-350 0.04
Clorofilla-A Etanolo 440 685 0.23
Eosina Acqua 521 544 0.16
Fluoresceina Acqua 437 515 0.92
Rodamina-B Etanolo 555 627 0.97
Tabella 1

Il coefficiente di estinzione, la resa quantistica, l’intensità luminosa media della sorgente luminosa e la durata della fluorescenza sono tutti fattori importanti che contribuiscono all’intensità e all’utilità dell’emissione di fluorescenza. Inoltre, l’ambiente localizzato che circonda il fluorocromo svolge un ruolo fondamentale nel determinare le caratteristiche dell’emissione di fluorescenza. Variabili come la viscosità del solvente, le concentrazioni ioniche, il pH e l’idrofobicità nell’ambiente possono avere effetti profondi sia sull’intensità della fluorescenza che sulla durata dello stato eccitato.

Spiegazione molecolare della fluorescenza

L’attività della fluorescenza è talvolta rappresentata schematicamente come mostrato nella Figura 4(a) (definita diagramma di energia di Jablonski). Prima dell’eccitazione, la configurazione elettronica della molecola è descritta come nello stato fondamentale. Dopo aver assorbito un fotone di luce di eccitazione, di solito di lunghezze d’onda corte, gli elettroni possono essere sollevati ad una maggiore energia e stato eccitato vibrazionale, un processo che può richiedere solo un quadrilionesimo di secondo (un periodo di tempo comunemente indicato come femtosecondo, 10E-15 secondi).

In fluorescenza, durante un intervallo di circa un trilionesimo di secondo (un picosecondo o 10E-12 secondi), gli elettroni eccitati possono perdere una certa energia vibrazionale per l’ambiente circostante e tornare a quello che viene chiamato il più basso stato singoletto eccitato. Dallo stato di singoletto eccitato più basso, gli elettroni sono quindi in grado di” rilassarsi ” di nuovo allo stato fondamentale con emissione simultanea di luce fluorescente come illustrato nella Figura 4(a). La luce emessa è sempre di lunghezza d’onda più lunga della luce di eccitazione (Legge di Stokes) e continua finché l’illuminazione di eccitazione bagna il campione fluorescente. Se la radiazione eccitante viene interrotta, la fluorescenza cessa.

Jablonski Energy Diagram

Esplora come un elettrone assorbe energia e trascende ad uno stato energetico superiore secondo un diagramma a livello di energia di Jablonski. Una volta che un elettrone è nello stato eccitato, si rilassa lentamente attraverso effetti vibrazionali e può quindi tornare allo stato fondamentale emettendo un fotone (fluorescenza).

Occasionalmente gli elettroni eccitati, invece di rilassarsi allo stato di singoletto più basso attraverso interazioni vibrazionali, fanno una transizione proibita allo stato di tripletta uscito e quindi allo stato fondamentale in un processo in cui l’emissione di radiazioni può essere notevolmente ritardata-fino a diversi secondi o più. Questo fenomeno è caratteristico della fosforescenza, come mostrato nella Figura 4 (b). In alcuni casi, gli elettroni eccitati possono passare dallo stato di tripletta allo stato di singoletto eccitato più basso e quindi tornare allo stato fondamentale, emettendo successivamente luce fluorescente. Questa azione richiede un po ‘ più di tempo (circa un microsecondo o due) rispetto alla fluorescenza usuale e viene chiamata fluorescenza ritardata (Figura 4(c)). In altre circostanze (ad esempio, photobleaching o la presenza di sali di metalli pesanti o altre sostanze chimiche), la luce emessa può essere significativamente ridotta o arrestata del tutto, come discusso di seguito.

Fading o Photobleaching

Ci sono condizioni specifiche che possono influenzare la ri-radiazione della luce da un fluoroforo eccitato, e quindi ridurre l’intensità della fluorescenza. Questa riduzione dell’intensità di emissione è generalmente chiamata fading o photobleaching. Alcuni autori suddividono ulteriormente lo sbiadimento in tempra e sbiancamento. Lo sbiancamento è la decomposizione irreversibile delle molecole fluorescenti a causa dell’intensità della luce in presenza di ossigeno molecolare. La tempra comporta anche una ridotta intensità di fluorescenza e spesso è causata da agenti ossidanti o dalla presenza di sali di metalli pesanti o composti alogeni.

Spesso, la tempra deriva dal trasferimento di energia ad altre molecole accettore fisicamente vicine ai fluorofori eccitati, un fenomeno noto come trasferimento di energia di risonanza. Questo particolare fenomeno è diventato la base per una nuova tecnica di misurazione di distanze molto al di sotto della risoluzione laterale del microscopio ottico.

Il verificarsi di sbiancamento ha portato ad una tecnica nota come FRAP, o recupero di fluorescenza dopo photobleaching. FRAP si basa su sbiancamento da brevi raffiche laser e successiva osservazione del recupero della fluorescenza causata dalla diffusione di fluorofori nella zona sbiancata.

Proprietà dei reagenti antifade più diffusi
Reagente antifade
p-fenilene-
diammina
Il reagente più efficace per FITC. Efficace anche per la rodamina. Deve essere regolato allo 0,1% di p-fenilendiammina in glicerolo/PBS per l’uso. Il reagente si annerisce se sottoposto a esposizione alla luce, quindi deve essere conservato in un luogo buio. Il contatto con la pelle è estremamente pericoloso.
DABCO
(1,4-diazabi-
ciclo-2,2,2-
ottano)
Altamente efficace per FITC. Sebbene il suo effetto sia leggermente inferiore alla p-fenilendiammina, è più resistente alla luce e presenta un livello di sicurezza più elevato.
n-propilgallato Il reagente più efficace per la rodamina, efficace anche per FITC. Deve essere regolato all ‘ 1% di propilgallato in glicerolo/PBS per l’uso.
2-mercapto-
etilammina
Utilizzato per osservare cromosomi e campioni di DNA colorati con ioduro di propidio, arancia acridina o cromomisina A3. Dovrebbe essere regolato a 0,1 mM 2-mercaptotheylamine in Tris-EDTA
Tabella 2

Per ridurre il grado di attenuazione in alcuni esemplari, può essere consigliabile l’uso di un filtro a densità neutra nel percorso della luce prima che l’illuminazione raggiunge il filtro di eccitazione, riducendo così l’intensità di luce di eccitazione. In altri casi, gli effetti di dissolvenza possono essere ridotti modificando il pH del mezzo di montaggio o utilizzando agenti sbiancanti (molti degli agenti più importanti sono elencati nella tabella 2). Per l’imaging digitale, la fotomicrografia o semplicemente l’osservazione visiva, cambiare rapidamente il campo visivo può anche evitare effetti di sbiadimento.

Autori

Mortimer Abramowitz-Olympus America, Inc., Due unità Centro aziendale., Melville, New York, 11747.

Michael W. Davidson-National High Magnetic Field Laboratory, 1800 East Paul Dirac Dr., La Florida State University, Tallahassee, Florida, 32310.

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