それらの新しい電子配置のために、蛍光色素は、吸収(通常は励起に類似し これらの吸収スペクトルと発光スペクトルは蛍光の相対強度を示し、相対強度は垂直軸に古典的にプロットされ、水平軸に波長がプロットされた。 所定の蛍光色素について、製造業者は、照明励起強度のピークの波長および蛍光発光強度のピークの波長を示す。 与えられた蛍光色素の励起および発光スペクトルを表示するグラフおよび曲線の起源を理解することが重要である。

特定の蛍光色素の発光スペクトルを決定するために、最大吸収の波長(通常は励起最大と同じ)が決定され、蛍光色素がその波長で励起される。 典型的な蛍光色素の吸収スペクトルは図1(a)に示されており、吸収の相対強度は測定された波長に対してプロットされています。 次に、モノクロメータ(狭い波長の光波長を通過させる装置)を使用して、一連の発光波長全体にわたって蛍光発光強度をスキャンします。 蛍光の相対強度は、図1(b)に示すように、発光スペクトルをプロットするために、さまざまな波長で測定されます。 与えられた蛍光色素の励起スペクトルは、最大強度の波長での蛍光発光を監視することによって同様の方法で決定され、蛍光色素は群の連続した波長を介して励起される。 発光の最大値が選択され、その波長の発光光のみが検出器に通過することが許される。 励起は様々な励起波長で(通常はモノクロメータによって)誘導され、放出された蛍光の強度は波長の関数として測定される。 その結果は、励起波長のスペクトルにわたって励起によって生成される相対的な蛍光強度を示すグラフまたは曲線(図1(a)に示される)である。

蛍光フィルタースペクトル

蛍光励起、発光、および二色フィルターのスペクトルプロファイルの重複領域と、透過特性の変化が様々なフィルターの組

いくつかの観測は、曲線やスペクトルの典型的な励起と発光セットから行うことができます。 通常、励起スペクトルの高波長端と発光スペクトルの低波長端との間には重複がある。 励起強度と発光強度と波長(図1(c)に示されている)のこの重複は、蛍光顕微鏡では、励起フィルタ、二色性ビームスプリッタ(反射光蛍光)、およびバリアまたは発光フィルタの適切な選択によって排除されなければならない。 さもなければ、大いにより明るい刺激ライトはより弱い出された蛍光性ライトを圧倒し、かなり標本の対照を減少させます。

電子が励起状態から基底状態になると(以下の分子説明の項を参照)、振動エネルギーが失われます。 その結果、発光スペクトルは励起スペクトルよりも長い波長にシフトする(波長は放射エネルギーに反比例して変化する)。 この現象はストークスの法則またはストークスシフトとして知られています。 ストークスシフトが大きければ大きいほど、励起光と発光光を分離するのが容易になります。 発光強度ピークは、通常、励起ピークよりも低く、発光曲線は、多くの場合、励起曲線の鏡像であるが、より長い波長にシフトする。 最大蛍光強度を達成するために、蛍光色素は、通常、励起曲線のピーク時の波長で励起され、発光検出は、発光曲線のピーク波長(または観察者によって選択された他の波長)で選択される。 励起波長と発光波長の選択は、適切なフィルタによって制御されます。 光学系のスペクトル応答を決定する際には、異なる波長のガラス透過率や検出器感度変数などの要因を考慮するための技術的な補正が必要です。

典型的な蛍光色素の吸収-放出スペクトル図を図2に示します。 この典型的な蛍光色素の吸収(通常は純粋な化合物の励起曲線と同様)および発光の蛍光強度の曲線は、形状が幾分類似していることに注意してくださ 励起と発光の間の波長シフトは、19世紀半ばから知られている(ストークスの法則)。 また、励起曲線と放出曲線は、励起の上端と放出曲線の下の波長で多少重複することに注意してください。

蛍光フィルターキューブ

励起フィルターとバリアフィルターのバンドパス波長領域の変化により、特定の波長帯が試料を照らし、他のすべてが除外されている間に検出器に通過する方法を発見します。

励起波長と発光波長の分離は、図3に示すように、スペクトルの特定の波長をブロックまたは通過させるためのフィルタを適切に選択することによ 蛍光性照明器の設計は標本の方に方法の軽い道に容易に可変性フィルター挿入によって刺激ライトおよび放出ライトの制御に基づいて、次に標本 低い発光強度の観点から,励起のために選択された光源は,比較的弱い発光光を最大にすることができるように十分な明るさであり,満足のいく吸収と収率の蛍光色素を選択することが重要である。

蛍光色素が励起光を吸収する効率は吸光係数として知られている。 吸光係数が大きいほど、与えられた波長領域における光吸収の可能性が大きくなる(その後の蛍光発光の前提条件)。 放出された光の収率は、量子収率、吸収された量子の数と比較して放出される量子(エネルギーの「パケット」)の数の比(通常、収率は0.1〜0.9の間である)と呼ばれ 1以下の量子収率は、蛍光の再放射経路ではなく、非放射経路(熱または光化学反応など)を介したエネルギーの損失の結果である。 以下の表1に、選択された蛍光色素の群のための蛍光量子収率を列挙する。 いくつかの量子収率は些細なように見える(ベンゼン)が、他のものは非常に効率的である(フルオレセインとローダミン-B)ことに注意してください。

蛍光色素蛍光量子収率
化合物 溶媒 励起
波長
(nm)
発光
波長
(nm)
量子収率
アクリジンオレンジ エタノール 493 535 0.46
ベンゼン エタノール 248 300-350 0.04
クロロフィルA エタノール 440 685 0.23
エオシン 521 544 0.16
フルオレセイン 437 515 0.92
ローダミンB エタノール 555 627 0.97
テーブル1

消光係数、量子収率、光源の平均光度、および蛍光寿命は、蛍光発光の強度および有用性に寄与するすべての重要な要因である。 さらに、蛍光色素を取り巻く局所環境は、蛍光発光の特性を決定する上で最も重要な役割を果たしている。 環境中の溶媒粘度、イオン濃度、pH、疎水性などの変数は、蛍光強度と励起状態の寿命の両方に大きな影響を与える可能性があります。

蛍光の分子説明

蛍光活性は、図4(a)に示すように図式的に描かれることがあります(ジャブロンスキエネルギーダイアグラムと呼ばれます)。 励起の前に、分子の電子配置は基底状態にあると記述される。 通常は短波長の励起光の光子を吸収すると、電子はより高いエネルギーと振動励起状態に上昇することがあり、これは秒の四分の一(一般にフェムト秒、10E-15秒と呼ばれる時間)しかかからないプロセスである。

蛍光では、約1兆分の1秒(ピコ秒または10E-12秒)の間隔の間に、励起された電子は周囲の環境に振動エネルギーを失い、最も低い励起一重項状態と呼ばれるものに戻る可能性がある。 最も低い励起一重項状態から、電子は、図4(a)に示すように、蛍光光の同時放出によって基底状態に戻ることができる。 放出された光は、励起光よりも常に長波長であり(ストークスの法則)、励起照明が蛍光試料を浴びせる限り継続する。 励起放射線が停止すると、蛍光は停止する。

Jablonskiエネルギー図

jablonskiエネルギー準位図に従って、電子がエネルギーを吸収し、より高いエネルギー状態にどのように超越するかを探る。 電子が励起状態になると、それは振動効果によってゆっくりと緩和され、光子(蛍光)を放出することによって基底状態に戻ることができる。

励起された電子は、振動相互作用によって最も低い一重項状態に緩和されるのではなく、放射の放出が数秒以上までかなり遅れる過程で、放出された三重項状態への禁断の遷移を行い、基底状態へと遷移することがある。 この現象は、図4(b)に示すように、燐光の特徴です。 いくつかの例では、励起された電子は三重項状態から最低励起一重項状態に戻り、次いで基底状態に戻り、続いて蛍光光を放出することができる。 この作用は、通常の蛍光よりも少し長く(約1マイクロ秒または2マイクロ秒)かかり、遅延蛍光と呼ばれます(図4(c))。 他の状況(例えば、光退色または重金属または他の化学物質の塩の存在)の下で、放出された光は、以下で議論されるように、著しく減少または完全に停止

フェージングまたは光退色

励起された蛍光体による光の再放射に影響を与え、蛍光強度を低下させる可能性のある特定の条件があります。 この発光強度の減少は、一般にフェージングまたは光退色と呼ばれます。 いくつかの著者はさらに消光と漂白にフェージングを細分化します。 漂白は、分子酸素の存在下での光強度のために蛍光分子の不可逆的分解である。 焼入れはまた、蛍光強度の低下をもたらし、酸化剤または重金属またはハロゲン化合物の塩の存在の結果として頻繁にもたらされる。

多くの場合、クエンチングは励起された蛍光体に物理的に近い他のアクセプター分子へのエネルギーの移動に起因し、共鳴エネルギー移動として知られている現象である。 この特定の現象は、光学顕微鏡の横方向分解能よりはるかに低い距離を測定する新しい技術の基礎となっている。

漂白の発生は、FRAP、または光漂白後の蛍光回復として知られている技術につながっています。 FRAPは、短いレーザーバーストによる漂白と、漂白された領域への蛍光色素の拡散によって引き起こされる蛍光の回復のその後の観察に基づいています。

人気のアンチフェード試薬の特性
アンチフェード試薬
P-フェニレン-
ジアミン
FITCの最も効果的な試薬です。 ローダミンにも効果的です。 使用のためにグリセロール/PBSの0.1%p-phenylenediamineに合わせられるべきです。 試薬は露光に服従させたとき黒くなります従って暗い場所で貯えられるべきです。 皮膚の接触は非常に危険です。
DABCO
(1,4-diazabi-
cyclo-2,2,2-
octane)
FITCに非常に効果的です。 その効果はp-フェニレンジアミンよりわずかに低いが、それは光に対してより耐性があり、より高いレベルの安全性を特徴とする。
N-プロピルガラート Rhodamineのための最も有効な試薬、FITCのためにまた有効。 使用のためにグリセロール/PBSの1%のpropylgallateに調節されるべきです。
2-mercapto-
ethylamine
ヨウ化プロピジウム、アクリジンオレンジ、またはクロモミシンA3で染色された染色体およびDNA標本を観察するために使用されます。 トリスEDTAの0.1mMの2メルカプトテイルアミンに調節されるべきです
テーブル2

いくつかの試験片の退色の程度を低減するために、照明が励起フィルタに到達し、励起光強度を減少させる前に、光路に中性密度フィルタを使用することが推奨される場合がある。 他の例では、退色効果は、装着媒体のpHを変化させることによって、または抗漂白剤を使用することによって低減され得る(より重要な薬剤のいくつかは、表2に列挙されている)。 デジタル画像、顕微鏡写真、または単に視覚観察のために、急速に視野を変えることはまた衰退の効果を避けるかもしれません。

寄稿者

Mortimer Abramowitz-Olympus America,Inc.、二つの企業センタードライブ。,メルヴィル,ニューヨーク,11747.

Michael W.Davidson-National High Magnetic Field Laboratory,1800East Paul Dirac Dr.,フロリダ州立大学,タラハシー,フロリダ州,32310.

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