그들의 새로운 전자 구성 때문에 형광 색소는 흡수(일반적으로 여기와 유사)및 방출에 대 한 고유 하 고 특성 스펙트럼. 이러한 흡수 및 방출 스펙트럼은 형광의 상대 강도를 보여 주며,수직 축에 고전적으로 그려지는 상대 강도 대 가로 축의 파장. 주어진 플루오로 크롬의 경우,제조업체는 조명 여기 강도의 피크에 대한 파장과 형광 방출 강도의 피크에 대한 파장을 나타냅니다. 주어진 플루오로 크롬에 대한 여기 및 방출 스펙트럼을 표시하는 그래프와 곡선의 기원을 이해하는 것이 중요합니다.

특정 플루오로 크롬의 방출 스펙트럼을 결정하기 위해 최대 흡수 파장(일반적으로 여기 최대 파장과 동일)이 결정되고 플루오로 크롬은 그 파장에서 여기됩니다. 일반적인 플루오로 크롬의 흡수 스펙트럼은 그림 1(에이)에서 측정 된 파장에 대해 상대적인 흡수 강도를 플롯합니다. 모노 크로 메이터(좁은 파장의 광 대역을 통과 할 수있는 장치)는 전체 일련의 방출 파장에 걸쳐 형광 방출 강도를 스캔하는 데 사용됩니다. 형광의 상대 강도는 다양한 파장에서 측정되어 방출 스펙트럼을 플롯합니다. 주어진 플루오로 크롬의 여기 스펙트럼은 플루오로 포어가 그룹 연속 파장을 통해 여기되는 동안 최대 강도의 파장에서 형광 방출을 모니터링하여 유사한 방식으로 결정됩니다. 방출 최대는 선택되고 그 파장에 방출 빛만 발견자에 통과하는 것이 허용됩니다. 여기는 다양한 여기 파장에서(일반적으로 모노크롬메이터를 통해)유도되며 방출된 형광의 강도는 파장의 함수로 측정됩니다. 결과는 여기 파장의 스펙트럼을 통해 여기에 의해 생성 된 상대 형광 강도를 나타내는 그래프 또는 곡선(그림 1(에이)에 나와 있음)입니다.

형광 필터 스펙트럼

형광 여기,방출 및 이색 필터 스펙트럼 프로파일의 겹침 영역과 전송 특성의 변화가 다양한 필터 조합을 통해 전달되는 파장의 대역폭을 결정하는 방법을 살펴보십시오.

곡선 또는 스펙트럼의 전형적인 여기 및 방출 세트에서 몇 가지 관찰을 할 수 있습니다. 일반적으로 여기 스펙트럼의 더 높은 파장 끝과 방출 스펙트럼의 더 낮은 파장 끝 사이에 중첩이 있습니다. 여기 및 방출 강도 및 파장(그림 1(다))의 중복 제거 해야 합니다.,형광 현미경 검사 법,여기 필터,이색 빔 스플리터(반사광 형광),및 장벽 또는 방출 필터에 대 한 적절 한 선택에 의해. 그렇지 않으면 훨씬 밝은 여기 광이 약한 방출 된 형광 광을 압도하고 표본 대비를 크게 줄입니다.

전자가 여기 상태에서 접지 상태로 이동하면(분자 설명 아래 섹션 참조)진동 에너지가 손실됩니다. 결과적으로 방출 스펙트럼은 여기 스펙트럼보다 긴 파장으로 이동합니다(파장은 복사 에너지에 반비례합니다). 이 현상을 스톡스 법 또는 스톡스 시프트. 스톡스 시프트가 클수록 여기 광과 방출 광을 쉽게 분리할 수 있습니다. 방출 강도 피크는 일반적으로 여기 피크보다 낮으며 방출 곡선은 종종 여기 곡선의 미러 이미지이지만 더 긴 파장으로 이동했습니다. 최대 형광 강도를 달성하기 위해,형광색은 일반적으로 여기 곡선의 피크에서의 파장에서 여기되고,방출 검출은 방출 곡선의 피크 파장(또는 관찰자에 의해 선택된 다른 파장)에서 선택된다. 여기 파장 및 방출 파장의 선택은 적절한 필터에 의해 제어됩니다. 광학 시스템의 스펙트럼 응답을 결정할 때,다양한 파장에 대한 유리 투과 및 검출기 감도 변수와 같은 요인을 고려하기 위해 기술적 수정이 필요합니다.

전형적인 플루오로 크롬 흡수 방출 스펙트럼 다이어그램이 그림 2 에 나와 있습니다. 흡수에 대한 형광 강도 곡선(일반적으로 순수 화합물에 대한 여기 곡선과 유사)과이 전형적인 플루오로 크롬에 대한 방출은 모양이 다소 유사합니다. 여기와 방출 사이의 파장 이동은 19 세기 중반(스톡스 법칙)부터 알려져 왔습니다. 또한 여기 곡선과 방출 곡선은 여기 곡선의 위쪽 끝과 방출 곡선의 아래쪽 파장에서 다소 겹칩니다.

형광 필터 큐브

여기 필터 및 배리어 필터의 대역 통과 파장 영역의 변화가 특정 파장 대역이 시편을 비추고 다른 모든 파장이 제외되는 동안 검출기로 통과하는 방법을 알아보십시오.

여기 파장과 방출 파장의 분리는 그림 3 에 제시된 바와 같이 스펙트럼의 특정 파장을 차단하거나 통과하기 위해 필터를 적절하게 선택함으로써 달성됩니다. 형광 조명기의 설계는 시편으로 향하는 도중에 광 경로에 필터를 삽입하고 시편에서 방출하여 여기 광 및 방출 광의 제어를 기반으로합니다. 낮은 방출 강도의 관점에서,여기를 위해 선택된 광원이 상대적으로 약한 방출 광이 최대화 될 수 있도록 충분한 밝기를 가지며,만족스러운 흡수 및 수율의 플루오로 크롬을 선택하는 것이 중요하다.

플루오로 크롬이 여기 광을 흡수하는 효율은 소멸 계수로 알려져 있습니다. 소멸 계수가 클수록 주어진 파장 영역(계속되는 형광 방출에 대한 전제 조건)에서 광 흡수의 가능성이 커집니다. 방출 된 빛의 수율은 흡수 된 양자의 수와 비교하여 방출 된 양자의 수(에너지의”패킷”)의 비율 인 양자 수율이라고합니다(일반적으로 수율은 0.1 에서 0.9 사이). 1 이하의 양자 수율은 형광의 재 복사 경로보다는 비 복사 경로(예:열 또는 광화학 반응)를 통한 에너지 손실의 결과입니다. 표 1 에 아래에 나열된 것은 선택된 플루오로크롬 그룹에 대한 형광 양자 수율입니다. 일부 양자 수율은 사소한 것(벤젠)이지만 다른 양자 수율은 매우 효율적입니다(플루오 레세 인 과 로다 민-비).

형광 형광 양자 수율
화합물 용매 여기
파장
(나노미터)
방출
파장
(나노미터)
양자 수율
아크리딘 오렌지 에탄올 493 535 0.46
벤젠 에탄올 248 300-350 0.04
엽록소- 에탄올 440 685 0.23
에오신 521 544 0.16
플루오레세인 437 515 0.92
2018 년 10 월 1 일 555 627 0.97
표 1

소멸 계수,양자 수율,광원의 평균 광도 및 형광 수명은 모두 형광 방출의 강도와 유용성에 기여하는 중요한 요소입니다. 또한,지역화 된 환경 형광 색소를 둘러싼 형광 방출의 특성을 결정 하는 파라마운트 역할을 한다. 용 매 점도,이온 농도,산도,환경에서의 소수성 등 변수 형광 강도 및 여기 상태의 수명에 지대한 영향을 미칠 수 있습니다.

형광의 분자 설명

형광 활성은 도 4(에이)(자블론스키 에너지 다이어그램이라고 함)에 도시된 바와 같이 도식적으로 묘사되기도 한다. 여기 이전에,분자의 전자 구성은 접지 상태에있는 것으로 설명된다. 일반적으로 짧은 파장의 여기 빛의 광자를 흡수하면 전자는 더 높은 에너지 및 진동 여기 상태로 상승 할 수 있습니다.이 과정은 4 조분의 1 초만 걸릴 수 있습니다(일반적으로 펨토초,10 초-15 초).

형광에서,약 1 조분의 1 초(피코세컨드 또는 10 초-12 초)의 간격 동안,여기된 전자는 주변 환경에 대한 약간의 진동 에너지를 잃고 가장 낮은 여기된 일중항 상태로 되돌아갈 수 있다. 가장 낮은 여기된 일중항 상태로부터,전자는 그림 4(에이)에 도시된 바와 같이 형광등의 동시 방출과 함께 접지 상태로 다시”이완”할 수 있다. 방출 된 빛은 항상 여기 빛(스톡스 법칙)보다 파장이 길며 여기 조명이 형광 표본을 목욕시키는 한 계속됩니다. 흥미로운 방사선이 중단되면 형광이 중단됩니다.

자블론스키 에너지 다이어그램

자블론스키 에너지 레벨 다이어그램에 따라 전자가 에너지를 흡수하고 더 높은 에너지 상태로 초월하는 방법을 탐색하십시오. 일단 전자가 여기 상태에 있으면 진동 효과를 통해 천천히 이완 된 다음 광자(형광)를 방출하여 접지 상태로 다시 떨어질 수 있습니다.

때때로 여기 된 전자는 진동 상호 작용을 통해 가장 낮은 일중항 상태로 이완하는 대신 방출 된 삼중 항 상태로 금지 된 전이를 한 다음 방사선의 방출이 상당히 지연 될 수있는 과정에서 최대 몇 초 이상 지연 될 수 있습니다. 이 현상은 그림 4 와 같이 인광의 특징입니다. 어떤 경우들에서,여기된 전자는 삼중항 상태로부터 가장 낮은 여기된 일중항 상태로 되돌아갈 수 있고,이어서 접지 상태로 되돌아갈 수 있고,이후에 형광등을 방출할 수 있다. 이 작업은 일반적인 형광보다 조금 더 오래 걸립니다(약 1 마이크로 초 또는 2 초)지연 형광이라고합니다(그림 4(기음)). 다른 상황(예:광 표백 또는 중금속 또는 기타 화학 물질의 염의 존재)에서 방출 된 빛은 아래에서 논의 된 바와 같이 크게 감소되거나 완전히 중단 될 수 있습니다.

퇴색 또는 광표백

여기 형광 단자에 의한 빛의 재 방사에 영향을 미칠 수있는 특정 조건이 있으므로 형광의 강도를 감소시킵니다. 이러한 방출 강도의 감소를 일반적으로 페이딩 또는 광 표백이라고합니다. 일부 저자는 퇴색을 담금질 및 표백으로 세분화합니다. 표백은 분자 산소의 면전에서 가벼운 강렬 때문에 형광성 분자의 돌이킬 수 없는 분해입니다. 담금질은 또한 형광 강도를 감소시키고 산화제 또는 중금속 또는 할로겐 화합물의 염의 존재로 인해 자주 발생합니다.

종종 담금질은 흥분된 플루오로 포어에 물리적으로 가까운 다른 수용체 분자로의 에너지 전달에서 비롯되며,이는 공명 에너지 전달로 알려진 현상이다. 이 특별한 현상은 현미경의 측면 해상도보다 훨씬 낮은 거리를 측정하는 새로운 기술의 기초가되었습니다.

표백의 발생으로 알려진 기술로 이어졌습니다. 플랩은 짧은 레이저 파열에 의해 표백 및 표백 영역으로 형광체의 확산에 의해 발생 형광의 회복의 후속 관찰에 기초한다.

인기있는 안티 페이드 시약의 특성
안티페이드 시약
피-페닐 렌-
디아민
가장 효과적인 시약. 또한 로다 민에 효과적입니다. 1.사용 후 15~20 분 정도 기다려야합니다. 시약은 가벼운 노출을 복종될 때 검게 합니다 그래서 어두운 장소에서 저장되어야 합니다. 피부 접촉은 매우 위험합니다.
(1,4-디아자비-
사이클로-2,2,2-
옥탄가)
그 효과는 피-페닐 렌 디아민보다 약간 낮지 만 빛에 더 강하며 더 높은 수준의 안전성을 특징으로합니다.
로다 민에 대한 가장 효과적인 시약은 또한 피트에 효과적입니다. 사용 하기 위해 글리세롤/피에 1%프로필 갈 레이트를 조정 해야 합니다.
2-염색체를 관찰하기 위해,염색체를 관찰하기 위해,염색체를 관찰하기 위해,염색체를 관찰하기 위해 사용된다. 2-메르 캅토 테일 아민 에 트리스 에타
표 2

일부 시편에서 페이딩 정도를 줄이기 위해 조명이 여기 필터에 도달하기 전에 광 경로에 중성 밀도 필터를 사용하여 여기 광 강도를 줄이는 것이 좋습니다. 다른 경우에,페이딩 효과는 장착 매체의 산도를 변경하거나 표백 방지제를 사용함으로써 감소 될 수있다(더 중요한 제제의 몇몇은 표 2 에 열거되어있다). 디지털 이미징,사진 마이크로 그라피 또는 단순히 시각적 관찰의 경우 시야를 빠르게 변경하면 페이딩 효과를 피할 수 있습니다.

기고 저자

모티머 아브라모비츠-올림푸스 아메리카,주식 회사,두 개의 기업 센터 드라이브.,멜빌,뉴욕,11747.

마이클 더블유 데이비슨-국립 높은 자기장 연구소,1800 이스트 폴 디락 박사.,플로리다 주립 대학,탤러,플로리다,32310.

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