på grunn av deres nye elektroniske konfigurasjoner, fluorokromer har unike og karakteristiske spektra for absorpsjon (vanligvis lik eksitasjon) og utslipp. Disse absorpsjons – og emisjonsspektrene viser relativ intensitet av fluorescens, med den relative intensiteten klassisk plottet på den vertikale aksen versus bølgelengden på den horisontale aksen. For et gitt fluorokrom indikerer produsentene bølgelengden for toppen av belysningseksitasjonsintensiteten og bølgelengden for toppen av fluorescensemisjonsintensiteten. Det er viktig å forstå opprinnelsen til grafer og kurver som viser eksitasjons – og emisjonsspektrene for et gitt fluorokrom.

for å bestemme utslippsspekteret til et bestemt fluorokrom, bestemmes bølgelengden av maksimal absorpsjon (vanligvis den samme som eksitasjonsmaksimum) og fluorokromet blir eksitert ved den bølgelengden. Absorpsjonsspekteret til et typisk fluorokrom er illustrert I Figur 1 (a) hvor den relative intensiteten av absorpsjon er plottet mot den målte bølgelengden. En monokromator (en enhet som tillater smale bånd av lysbølgelengder å passere) brukes deretter til å skanne fluorescensutslippsintensiteten over hele serien av utslippsbølgelengder. Fluorescensens relative intensitet måles ved de forskjellige bølgelengder for å plotte utslippsspekteret, som illustrert i Figur 1 (b). Eksitasjonsspekteret til et gitt fluorokrom bestemmes på en lignende måte ved å overvåke fluorescensutslipp ved bølgelengden av maksimal intensitet mens fluoroforen blir eksitert gjennom en gruppe påfølgende bølgelengder. Utslippsmaksimum er valgt, og bare utslippslys ved den bølgelengden får lov til å passere til detektoren. Eksitasjon induseres (vanligvis ved hjelp av en monokromator) ved forskjellige eksitasjonsbølgelengder, og intensiteten av den utstrålede fluorescens måles som en funksjon av bølgelengden. Resultatet er en graf eller kurve (illustrert I Figur 1 (a)), som viser den relative fluorescensintensiteten produsert av eksitasjon over spekteret av eksitasjonsbølgelengder.

Fluorescens Filter Spektra

Utforsk overlappende regioner av fluorescens eksitasjon, utslipp, og dikromatisk filter spektral profiler og hvordan endringer i overføring egenskaper bestemme båndbredden av bølgelengder gått gjennom ulike filterkombinasjoner.

Flere observasjoner kan gjøres fra et typisk eksitasjons – og emisjonssett med kurver eller spektra. Det er vanligvis en overlapping mellom den høyere bølgelengdeenden av eksitasjonsspekteret og den nedre bølgelengdeenden av emisjonsspekteret. Denne overlappingen av eksitasjon og utslippsintensiteter og bølgelengder (illustrert I Figur 1(c)) må elimineres, i fluorescensmikroskopi, ved hjelp av riktig valg for et eksitasjonsfilter, dikromatisk stråleplitter (i reflektert lysfluorescens) og barriere eller utslippsfilter. Ellers overvelder det mye lysere eksitasjonslyset det svakere utstrålede fluorescenslyset og reduserer prøvekontrasten betydelig.

når elektroner går fra opphisset tilstand til grunntilstanden (se Avsnittet Under Med Tittelen Molekylær Forklaring), er det et tap av vibrasjonsenergi. Som et resultat blir utslippsspekteret skiftet til lengre bølgelengder enn eksitasjonsspekteret (bølgelengden varierer omvendt til strålingsenergi). Dette fenomenet er Kjent Som Stokes Law Eller Stokes shift. Jo større stokes skift, jo lettere er det å skille eksitasjon lys fra utslipp lys. Emisjonsintensitetstoppen er vanligvis lavere enn eksitasjonstoppen, og emisjonskurven er ofte et speilbilde av eksitasjonskurven, men skiftet til lengre bølgelengder. For å oppnå maksimal fluorescensintensitet blir fluorokromet vanligvis begeistret ved bølgelengden ved toppen av eksitasjonskurven, og utslippsdeteksjonen velges ved toppbølgelengden (eller andre bølgelengder valgt av observatøren) av utslippskurven. Valgene av eksitasjonsbølgelengder og utslippsbølgelengder styres av passende filtre. Ved å bestemme spektralresponsen til et optisk system, er det nødvendig med tekniske korreksjoner for å ta hensyn til faktorer som glassoverføring og detektorfølsomhetsvariabler for forskjellige bølgelengder.

et typisk fluorokrom absorpsjons-emisjonsspektraldiagram er illustrert I Figur 2. Merk at kurvene av fluorescensintensitet for absorpsjon (vanligvis lik eksitasjonskurven for rene forbindelser) og utslipp for denne typiske fluorokrom er noe lik i form. Bølgelengdeskiftet mellom eksitasjon og utslipp har vært kjent siden midten Av det nittende århundre (Stokes Lov). Legg også merke til at eksitasjons – og emisjonskurvene overlapper noe i den øvre enden av eksitasjonen og de nedre bølgelengder av emisjonskurven.

Fluorescens Filter Kuber

Oppdag hvordan variasjoner i båndpass bølgelengdeområdet eksitasjon og barriere filtre tillate et bestemt bånd av bølgelengder for å belyse prøven, og deretter passere gjennom til detektoren mens alle andre er utelukket.

separasjonen av eksitasjons-og utslippsbølgelengder oppnås ved riktig valg av filtre for å blokkere eller passere spesifikke bølgelengder av spektret som presentert i Figur 3. Utformingen av fluorescensbelysningsapparater er basert på kontroll av eksitasjonslys og utslippslys ved lett foranderlige filterinnsatser i lysbanen på vei mot prøven og deretter kommer fra prøven. Det er viktig, med tanke på lav utslippsintensiteter, at lyskilden som er valgt for eksitasjon, er tilstrekkelig lysstyrke slik at det relativt svake utslippslyset kan maksimeres, og at fluorokromer med tilfredsstillende absorpsjon og utbytte velges.

effektiviteten som fluorokrom absorberer eksitasjonslyset er kjent som utryddelseskoeffisienten. Jo større utryddelseskoeffisienten er, desto større er muligheten for lysabsorpsjon i et gitt bølgelengdeområde (en forutsetning for påfølgende fluorescensutslipp). Utbyttet av utstrålet lys refereres til som kvanteutbyttet, forholdet mellom antall kvanta («pakker» av energi) som sendes ut i forhold til antall kvanta absorbert (vanligvis er utbyttet mellom 0,1 og 0,9). Kvanteutbyttet under 1 er resultatet av tap av energi gjennom ikke-strålingsveier (som varme eller en fotokjemisk reaksjon) i stedet for fluorescensens re-strålingsvei. Oppført nedenfor I Tabell 1 er fluorescenskvantumutbytter for en gruppe utvalgte fluorokromer. Legg merke til at noen kvanteutbytter virker trivielle (benzen) mens andre er svært effektive (Fluorescein og Rhodamin-B).

Fluorokrom Fluorescens Quantum Gir
Forbindelse Løsemiddel Eksitasjon
Bølgelengde
(nm)
Emisjon
Bølgelengde
(nm)
Kvanteutbytte
Akridin Oransje Etanol 493 535 0.46
Benzen Etanol 248 300-350 0.04
Klorofyll-A Etanol 440 685 0.23
Eosin Vann 521 544 0.16
Fluorescein Vann 437 515 0.92
Rhodamin-B Etanol 555 627 0.97
Tabell 1

Utryddelseskoeffisient, kvanteutbytte, gjennomsnittlig lysstyrke av lyskilden og fluorescenslevetid er alle viktige faktorer som bidrar til intensiteten og nytten av fluorescensutslipp. I tillegg spiller det lokaliserte miljøet rundt fluorokromet en viktig rolle for å bestemme egenskapene til fluorescensutslipp. Variabler som løsningsmiddelviskositet, ioniske konsentrasjoner, pH og hydrofobicitet i miljøet kan ha dype effekter på både fluorescensintensiteten og levetiden til den opphissede tilstanden.

Molekylær Forklaring Av Fluorescens

Fluorescensaktivitet er noen Ganger avbildet skjematisk som vist i Figur 4 (a) (betegnet et jablonski energidiagram). Før eksitasjon beskrives den elektroniske konfigurasjonen av molekylet som å være i grunntilstanden. Ved å absorbere en foton av eksitasjonslys, vanligvis med korte bølgelengder, kan elektroner heves til en høyere energi og vibrasjonsspent tilstand, en prosess som bare kan ta en quadrillionth av et sekund (en tidsperiode som ofte refereres til som en femtosekund, 10E-15 sekunder).

i fluorescens, i løpet av et intervall på omtrent en trillionth av et sekund (en picosecond eller 10E-12 sekunder), kan de eksiterte elektronene miste noe vibrasjonsenergi til omgivelsene og gå tilbake til det som kalles den laveste eksiterte singlet-tilstanden. Fra den laveste opphissede singlet-tilstanden kan elektronene da «slappe av» tilbake til grunntilstanden med samtidig utslipp av fluorescerende lys som illustrert i Figur 4(a). Det utstrålede lyset har alltid lengre bølgelengde enn eksitasjonslyset (Stokes Lov) og fortsetter så lenge eksitasjonsbelysningen bader det fluorescerende prøven. Hvis den spennende strålingen stoppes, opphører fluorescensen.

Jablonski Energidiagram

Utforsk hvordan et elektron absorberer energi og transcenderer til en høyere energitilstand i henhold til Et jablonski energinivådiagram. Når et elektron er i opphisset tilstand, slapper det sakte av gjennom vibrasjonseffekter og kan deretter slippe tilbake til grunntilstanden ved å sende ut en foton (fluorescens).

Av og til gjør de eksiterte elektronene, i stedet for å slappe av til den laveste singlet-tilstanden gjennom vibrasjonsinteraksjoner, en forbudt overgang til den utløpte tripletttilstanden og deretter til grunntilstanden i en prosess der strålingsutslippet kan bli betydelig forsinket-opptil flere sekunder eller mer. Dette fenomenet er karakteristisk for fosforescens, som vist i Figur 4 (b). I noen tilfeller kan de eksiterte elektronene gå fra tripletttilstanden tilbake til den laveste eksiterte singlettilstanden og deretter gå tilbake til grunntilstanden, og deretter sende ut fluorescerende lys. Denne handlingen tar litt lengre tid (omtrent et mikrosekund eller to) enn vanlig fluorescens og kalles forsinket fluorescens (Figur 4 (c)). Under andre omstendigheter (for eksempel photobleaching eller tilstedeværelse av salter av tungmetaller eller andre kjemikalier), kan utstrålt lys bli betydelig redusert eller stoppet helt, som omtalt nedenfor.

Fading eller Photobleaching

det er spesifikke forhold som kan påvirke re-stråling av lys av en spent fluorofor, og dermed redusere intensiteten av fluorescens. Denne reduksjonen av utslippsintensitet kalles vanligvis fading eller photobleaching. Noen forfattere deler videre fading i slukking og bleking. Bleking er irreversibel nedbrytning av fluorescerende molekyler på grunn av lysintensitet i nærvær av molekylært oksygen. Quenching resulterer også i redusert fluorescens intensitet og ofte er forårsaket som et resultat av oksidasjonsmidler eller tilstedeværelse av salter av tungmetaller eller halogenforbindelser.

ofte resulterer slokking fra overføring av energi til andre akseptormolekyler fysisk nær de eksiterte fluoroforene, et fenomen kjent som resonansenergioverføring. Dette spesielle fenomenet har blitt grunnlaget for en nyere teknikk for å måle avstander langt under lateral oppløsning av lysmikroskopet.

forekomsten av bleking har ført til en teknikk kjent som FRAP, eller fluorescensgjenoppretting etter fotobleking. FRAP er basert på bleking av korte laser bursts og påfølgende observasjon av gjenvinning av fluorescens forårsaket av diffusjon av fluoroforer i det blekede området.

Egenskaper Av Populære Antifade Reagenser
Antifade Reagens
p-fenylen-
diamin
det mest effektive reagenset FOR FITC. Også effektiv For Rhodamin. Bør justeres til 0,1% p-fenylendiamin i glyserol / PBS for bruk. Reagens blir mørkere når det utsettes for lyseksponering, så det skal oppbevares på et mørkt sted. Hudkontakt er ekstremt farlig.
DABCO
(1,4-diazabi-
cyclo-2,2,2 –
oktan)
svært effektiv FOR FITC. Selv om effekten er litt lavere enn p-fenylendiamin, er den mer motstandsdyktig mot lys og har et høyere sikkerhetsnivå.
n-propylgallat det mest effektive reagenset For Rhodamin, også effektivt FOR FITC. Bør justeres til 1% propylgallat i glyserol / PBS for bruk.
2-merkapto –
etylamin
Brukes Til å observere kromosom-OG DNA-prøver farget med propidiumjodid, akridinorange eller Kromomysin A3. Bør justeres til 0,1 mM 2-merkaptoteylamin I Tris-EDTA
Tabell 2

for å redusere graden av fading i noen prøver, kan det være tilrådelig å bruke et nøytralt tetthetsfilter i lysbanen før belysningen når eksitasjonsfilteret, og dermed redusere eksitasjonslysintensiteten. I andre tilfeller kan falming effekter reduseres ved å endre pH av monteringsmediet eller ved hjelp av anti-blekemidler (flere av de viktigste midlene er oppført I Tabell 2). For digital bildebehandling, fotomikrografi, eller bare visuell observasjon, raskt endre synsfeltet kan også unngå falming effekter.

Bidragsytere

Mortimer Abramowitz – Olympus America, Inc., To Corporate Center Drive. Melville, New York, 11747.

Michael W. Davidson-Nasjonalt Høyt Magnetfeltlaboratorium, 1800 East Paul Dirac Dr. Florida State University, Tallahassee, Florida, 32310.

Legg igjen en kommentar

Din e-postadresse vil ikke bli publisert.