vanwege hun nieuwe elektronische configuraties hebben fluorochromen unieke en karakteristieke spectra voor absorptie (meestal vergelijkbaar met excitatie) en emissie. Deze absorptie – en emissiespectra tonen relatieve intensiteit van fluorescentie, met de relatieve intensiteit die klassiek op de verticale as wordt uitgezet versus golflengte op de horizontale as. Voor een gegeven fluorochroom, geven de fabrikanten de golflengte voor de piek van de intensiteit van de verlichtingsopwekking en de golflengte voor de piek van de intensiteit van de fluorescentieemissie aan. Het is belangrijk om de oorsprong van de grafieken en krommen te begrijpen die de opwinding en emissiespectra voor een gegeven fluorochroom weergeven.

om het emissiespectrum van een bepaald fluorochroom te bepalen, wordt de golflengte van de maximale absorptie (meestal hetzelfde als het excitatiemaximum) bepaald en wordt het fluorochroom bij die golflengte opgewekt. Het absorptiespectrum van een typisch fluorochroom wordt geïllustreerd in Figuur 1(a), waarbij de relatieve absorptieintensiteit wordt uitgezet tegen de gemeten golflengte. Een monochromator (een apparaat dat smalle banden van lichte golflengten toestaat om over te gaan) wordt dan gebruikt om de intensiteit van de fluorescentieemissie over de volledige reeks van emissiegolflengten af te tasten. De relatieve intensiteit van de fluorescentie wordt gemeten bij de verschillende golflengten om het emissiespectrum uit te tekenen, zoals geïllustreerd in Figuur 1(b). Het opwindingsspectrum van een bepaald fluorochrome wordt bepaald op een gelijkaardige manier door fluorescentieemissie bij de golflengte van maximumintensiteit te controleren terwijl fluorophore door een groep opeenvolgende golflengten wordt opgewekt. Het emissiemaximum wordt gekozen en alleen emissielicht bij die golflengte mag naar de detector worden doorgegeven. De opwinding wordt veroorzaakt (gewoonlijk door middel van een monochromator) bij diverse opwindingsgolflengten en de intensiteit van de uitgezonden fluorescentie wordt gemeten als functie van golflengte. Het resultaat is een grafiek of een kromme (geïllustreerd in Figuur 1(a)), die de relatieve fluorescentieintensiteit voorstelt die door opwinding over het spectrum van opwindingsgolflengten wordt veroorzaakt.

Fluorescentiefilterspectra

onderzoek de overlappende gebieden van fluorescentie-excitatie -, emissie-en dichromatische filterspectrale profielen en hoe veranderingen in de transmissiekarakteristieken de bandbreedte bepalen van golflengten die door verschillende filtercombinaties worden doorgegeven.

verschillende waarnemingen kunnen worden gedaan aan de hand van een typische excitatie-en emissieset van curven of spectra. Er is gewoonlijk een overlapping tussen het hogere golflengteeind van het opwindingsspectrum en het lagere golflengteeind van het emissiespectrum. Deze overlapping van excitatie – en emissieintensiteiten en golflengten(afgebeeld in Figuur 1, onder c)) moet in de fluorescentiemicroscopie worden geëlimineerd door middel van de passende selectie voor een excitatiefilter, dichromatische beamsplitter (in gereflecteerde lichtfluorescentie) en barrière-of emissiefilter. Anders, overweldigt het veel helderder opwindingslicht het zwakkere uitgezonden fluorescentielicht en vermindert beduidend specimencontrast.

wanneer elektronen van de aangeslagen toestand naar de grondtoestand gaan (zie de paragraaf hieronder getiteld moleculaire verklaring), is er een verlies van trillingsenergie. Als gevolg hiervan wordt het emissiespectrum verschoven naar langere golflengten dan het excitatiespectrum (golflengte varieert omgekeerd aan stralingsenergie). Dit fenomeen staat bekend als Stokes Law of Stokes shift. Hoe groter de Stokes-verschuiving, hoe gemakkelijker het is om opwindingslicht van emissielicht te scheiden. De piek van de emissieintensiteit is gewoonlijk lager dan de opwindingspiek, en de emissiekromme is vaak een spiegelbeeld van de opwindingskromme, maar verschoven naar langere golflengten. Om maximale fluorescentieintensiteit te bereiken, wordt fluorochrome gewoonlijk opgewekt bij de golflengte bij de piek van de opwindingskromme, en wordt de emissieopsporing geselecteerd bij de piekgolflengte (of andere golflengten die door de waarnemer worden gekozen) van de emissiekromme. De selecties van excitatie golflengten en emissie golflengten worden gecontroleerd door geschikte filters. Bij het bepalen van de spectrale respons van een optisch systeem zijn technische correcties nodig om rekening te houden met factoren zoals glas transmissie en detector gevoeligheid variabelen voor verschillende golflengten.

een typisch fluorochrome absorptie-emissie spectraal diagram wordt geïllustreerd in Figuur 2. Merk op dat de krommen van fluorescentieintensiteit voor absorptie (gewoonlijk gelijkaardig aan de opwindingskromme voor zuivere samenstellingen) en emissie voor dit typische fluorochrome enigszins gelijkaardig in vorm zijn. De golflengteverschuiving tussen excitatie en emissie is al sinds het midden van de negentiende eeuw bekend (wet Stokes). Merk ook op dat de excitatie-en emissiekrommen enigszins overlappen aan de bovenkant van de excitatie en de lagere golflengten van de emissiekromme.

Fluorescentiefilterblokjes

ontdek hoe variaties in het golflengtegebied van excitatie-en barrièrefilters een specifieke golflengteband mogelijk maken om het monster te verlichten en vervolgens door te gaan naar de detector, terwijl alle andere zijn uitgesloten.

de scheiding tussen excitatie-en emissiegolflengten wordt bereikt door de juiste selectie van filters om specifieke golflengten van het spectrum te blokkeren of door te geven, zoals weergegeven in Figuur 3. Het ontwerp van fluorescentieverlichters is gebaseerd op controle van opwindingslicht en emissielicht door gemakkelijk veranderlijke filterinvoegingen in de lichte weg op de weg naar het specimen en dan emanating van het specimen. Gezien de lage emissieintensiteit is het van belang dat de voor de excitatie gekozen lichtbron voldoende helder is, zodat het relatief zwakke emissielicht kan worden gemaximaliseerd en dat fluorochromen met een bevredigende absorptie en opbrengst worden gekozen.

de efficiëntie waarmee het fluorochroom het opwindingslicht absorbeert staat bekend als de extinctiecoëfficiënt. Hoe groter de extinctiecoëfficiënt, hoe groter de mogelijkheid van lichtabsorptie in een bepaald golflengtegebied (een voorwaarde voor de daaropvolgende fluorescentie-emissie). De opbrengst van uitgestraald licht wordt aangeduid als de kwantumopbrengst, de verhouding van het aantal uitgestraalde quanta (“pakketten” energie) in vergelijking met het aantal geabsorbeerde quanta (meestal ligt de opbrengst tussen 0,1 en 0,9). De kwantumopbrengsten onder 1 zijn het resultaat van het verlies van energie door niet-stralende wegen (zoals hitte of een fotochemische reactie) eerder dan de re-stralende weg van fluorescentie. Hieronder in Tabel 1 staan de fluorescentiekwantumrendementen voor een groep geselecteerde fluorochromen. Merk op dat sommige kwantumopbrengsten triviaal lijken (benzeen) terwijl andere zeer efficiënt zijn (fluoresceïne en Rhodamine-B).

Fluorochroom Fluorescentie Quantum Opbrengsten
Samengestelde Oplosmiddel Excitatie
Golflengte
(nm)
Emissie
Golflengte
(nm)
Quantum Yield
Acridine Oranje Ethanol 493 535 0.46
Benzeen Ethanol 248 300-350 0.04
Chlorofyl-A Ethanol 440 685 0.23
Eosine Water 521 544 0.16
Fluoresceïne Water 437 515 0.92
Rhodamine-B Ethanol 555 627 0.97
Tabel 1

Extinctiecoëfficiënt, kwantumopbrengst, gemiddelde lichtsterkte van de lichtbron, en fluorescentie leven zijn alle belangrijke factoren die bijdragen aan de intensiteit en het nut van fluorescentie-emissie. Bovendien speelt het gelokaliseerde milieu dat fluorochrome omringt een primordiale rol in het bepalen van de kenmerken van fluorescentieemissie. De variabelen zoals oplosbare viscositeit, Ionische concentraties, pH, en hydrophobicity in het milieu kunnen diepgaande gevolgen op zowel de fluorescentieintensiteit als het leven van de opgewekte staat hebben.

moleculaire verklaring van de fluorescentie

de Fluorescentieactiviteit wordt soms schematisch weergegeven zoals weergegeven in Figuur 4 (A) (een Jablonski-energiediagram genoemd). Voorafgaand aan opwinding, wordt de elektronische configuratie van de molecule beschreven zoals zich in de grondstaat bevindt. Bij het absorberen van een foton van excitatielicht, meestal van korte golflengten, elektronen kunnen worden verhoogd tot een hogere energie en vibrationele opgewonden toestand, een proces dat slechts een biljard van een seconde (een tijdsperiode algemeen aangeduid als een femtoseconde, 10E-15 seconden).

in fluorescentie, tijdens een interval van ongeveer een biljoenste van een seconde (een picoseconde of 10E-12 seconden), kunnen de opgewekte elektronen wat trillingsenergie aan het omringende milieu verliezen en terugkeren naar wat de laagste opgewekte singletstaat wordt genoemd. Van de laagste opgewekte singlet staat, de elektronen zijn dan in staat om” ontspannen ” terug naar de grond staat met gelijktijdige emissie van fluorescerend licht zoals geïllustreerd in Figuur 4(a). Het uitgezonden licht is altijd van langere golflengte dan het opwindingslicht (de wet van Stokes) en gaat zo lang door als de opwindingsverlichting het fluorescente specimen baadt. Als de opwindende straling wordt gestopt, stopt de fluorescentie.

Jablonski-Energiediagram

onderzoek hoe een elektron energie absorbeert en transcendeert naar een hogere energietoestand volgens een Jablonski-energiediagram. Zodra een elektron in de opgewekte staat is, ontspant het langzaam door trillingsgevolgen en kan dan terug naar de grondstaat dalen door een foton (fluorescentie) uit te zenden.

soms maken de geëxciteerde elektronen, in plaats van door trillingsinteracties te ontspannen tot de laagste singlettoestand, een verboden overgang naar de uitgang van de triplettoestand en vervolgens naar de grondtoestand in een proces waarbij de emissie van straling aanzienlijk kan worden vertraagd-tot enkele seconden of meer. Dit verschijnsel is kenmerkend voor fosforescentie, zoals blijkt uit Figuur 4(b). In sommige gevallen, kunnen de opgewekte elektronen van de tripletstaat terug naar de laagste opgewekte singletstaat gaan en dan aan de grondstaat terugkeren, die later fluorescent licht uitzenden. Deze actie duurt iets langer (ongeveer een microseconde of twee) dan gebruikelijke fluorescentie en wordt vertraagde fluorescentie genoemd (Figuur 4(c)). Onder andere omstandigheden (bijvoorbeeld fotobleaching of de aanwezigheid van zouten van zware metalen of andere chemische stoffen) kan het uitgestraalde licht aanzienlijk worden verminderd of helemaal worden gestopt, zoals hieronder wordt besproken.

Fading of Photobleaching

er zijn specifieke voorwaarden die de herstraling van licht door een opgewekte fluorofoor kunnen beà nvloeden, en zo de intensiteit van fluorescentie verminderen. Deze vermindering van de emissie-intensiteit wordt over het algemeen fading of photobleaching genoemd. Sommige auteurs verder onderverdelen vervagen in doven en bleken. Het bleken is onomkeerbare ontbinding van de fluorescente molecules wegens lichtintensiteit in aanwezigheid van moleculaire zuurstof. Het doven resulteert ook in verminderde fluorescentieintensiteit en wordt vaak veroorzaakt als resultaat van oxyderende agenten of de aanwezigheid van zouten van zware metalen of halogeenverbindingen.

vaak resulteert het doven uit de overdracht van energie aan andere acceptormoleculen fysisch dicht bij de opgewekte fluoroforen, een fenomeen dat resonantie-energieoverdracht wordt genoemd. Dit bijzondere fenomeen is de basis geworden voor een nieuwere techniek om afstanden te meten ver onder de laterale resolutie van de lichtmicroscoop.

het voorkomen van bleken heeft geleid tot een techniek die bekend staat als FRAP, of fluorescentieherstel na fotobleaching. FRAP is gebaseerd op het bleken door korte laseruitbarstingen en latere observatie van de terugwinning van fluorescentie die door de verspreiding van fluorophores in het gebleekte gebied wordt veroorzaakt.

eigenschappen van populaire Antifade-reagentia
Antifade-reagens
p-fenyleen –
diamine
het meest effectieve reagens voor FITC. Ook effectief voor Rhodamine. Moet voor gebruik worden aangepast tot 0,1% p-fenyleendiamine in glycerol/PBS. Het reagens wordt zwart wanneer het wordt blootgesteld aan licht, zodat het op een donkere plaats moet worden opgeslagen. Huidcontact is extreem gevaarlijk.
DABCO
(1,4-diazabi-
cyclo-2,2,2-
octaan)
zeer effectief voor FITC. Hoewel het effect iets lager is dan p-fenyleendiamine, is het beter bestand tegen licht en beschikt over een hoger niveau van veiligheid.
n-propylgallaat het meest effectieve reagens voor Rhodamine, ook effectief voor FITC. Moet voor gebruik worden aangepast tot 1% propylgallaat in glycerol/PBS.
2-mercapto-
ethylamine
gebruikt om chromosoom-en DNA-monsters te observeren die gekleurd zijn met propidium jodide, acridine orange of Chromomysine A3. Moet worden aangepast tot 0,1 mM 2-mercaptotheylamine in Tris-EDTA
Tabel 2

om de graad van het verdwijnen in sommige specimens te verminderen, kan het raadzaam zijn om een neutrale dichtheidsfilter in de lichte weg te gebruiken alvorens de verlichting de opwindingsfilter bereikt, waarbij de opwindingslichtintensiteit wordt verminderd. In andere gevallen kunnen de vervagende effecten worden verminderd door de pH van het montagemiddel te veranderen of door gebruik te maken van bleekmiddelen (verschillende van de belangrijkste middelen zijn vermeld in Tabel 2). Voor digitale weergave, fotomicrografie, of eenvoudig visuele observatie, kan het snel veranderen van het gezichtsveld ook vermijd vervagende gevolgen.

Bijdragende Auteurs

Mortimer Abramowitz – Olympus America, Inc. Twee Corporate Center Drive. Melville, New York, 11747.

Michael W. Davidson-National High Magnetic Field Laboratory, 1800 East Paul Dirac Dr., De Florida State University, Tallahassee, Florida, 32310.

Geef een antwoord

Het e-mailadres wordt niet gepubliceerd.