ze względu na ich nowatorskie konfiguracje elektroniczne, fluorochromy mają unikalne i charakterystyczne widma absorpcji (zwykle podobne do wzbudzenia) i emisji. Te widma absorpcji i emisji wykazują względną intensywność fluorescencji, z względną intensywnością klasycznie wykreśloną na osi pionowej w porównaniu z długością fali na osi poziomej. Dla danego fluorochromu producenci wskazują długość fali dla szczytowego natężenia wzbudzenia oświetlenia i długość fali dla szczytowego natężenia emisji fluorescencji. Ważne jest zrozumienie pochodzenia wykresów i krzywych wyświetlających widma wzbudzenia i emisji dla danego fluorochromu.

w celu określenia widma emisyjnego określonego fluorochromu określa się długość fali maksymalnej absorpcji (zwykle taką samą jak maksimum wzbudzenia), a fluorochrom jest wzbudzony przy tej długości fali. Widmo absorpcji typowego fluorochromu zilustrowano na fig. 1 (a), gdzie względne natężenie absorpcji jest wykreślone na podstawie zmierzonej długości fali. Monochromator (urządzenie, które umożliwia przejście wąskich pasm długości fal świetlnych)jest następnie używany do skanowania natężenia emisji fluorescencji w całej serii fal emisji. Względne natężenie fluorescencji mierzy się dla różnych długości fal w celu wykreślenia widma emisji, jak pokazano na fig. 1 (b). Widmo wzbudzenia danego fluorochromu określa się w podobny sposób przez monitorowanie emisji fluorescencji przy długości fali maksymalnej intensywności, podczas gdy fluorofor jest wzbudzony przez grupę kolejnych długości fal. Wybiera się maksimum emisji i tylko światło emisyjne o tej długości fali może przejść do detektora. Wzbudzenie jest indukowane (zwykle za pomocą monochromatora) przy różnych długościach fal wzbudzenia, a intensywność emitowanej fluorescencji jest mierzona w funkcji długości fali. Wynikiem jest wykres lub krzywa (zilustrowane na rysunku 1 (a)), który przedstawia względną intensywność fluorescencji wytwarzanej przez wzbudzenie w widmie fal wzbudzenia.

widma filtra fluorescencyjnego

poznaj nakładające się regiony wzbudzenia fluorescencji, emisji i profili widmowych filtra dichromatycznego oraz sposób, w jaki zmiany charakterystyki transmisji określają szerokość pasma fal przepuszczanych przez różne kombinacje filtrów.

można wykonać kilka obserwacji z typowego zestawu krzywych lub widm wzbudzenia i emisji. Zwykle zachodzi nakładanie się wyższej długości fali widma wzbudzenia i niższej długości fali widma emisji. To nakładanie się intensywności wzbudzenia i emisji oraz długości fal (zilustrowane na fig. 1 (c)) musi zostać wyeliminowane w mikroskopii fluorescencyjnej za pomocą odpowiedniego doboru filtra wzbudzenia, dichromatycznego rozsiewacza wiązki (w fluorescencji światła odbitego) oraz filtra barierowego lub emisyjnego. W przeciwnym razie znacznie jaśniejsze światło wzbudzenia przytłacza słabsze emitowane światło fluorescencyjne i znacznie zmniejsza kontrast próbki.

kiedy elektrony przechodzą ze stanu wzbudzonego do stanu podstawowego (patrz sekcja poniżej zatytułowana Wyjaśnienie molekularne), następuje utrata energii wibracyjnej. W rezultacie widmo emisyjne jest przesunięte na dłuższe fale niż widmo wzbudzenia (długość fali zmienia się odwrotnie do energii promieniowania). Zjawisko to jest znane jako prawo Stokesa lub przesunięcie Stokesa. Im większe przesunięcie Stokesa, tym łatwiej jest oddzielić światło wzbudzenia od światła emisji. Szczyt intensywności emisji jest zwykle niższy niż szczyt wzbudzenia, a krzywa emisji jest często lustrzanym odbiciem krzywej wzbudzenia, ale przesunięta na dłuższe długości fal. W celu osiągnięcia maksymalnej intensywności fluorescencji fluorochrom jest zwykle wzbudzany przy długości fali na szczycie krzywej wzbudzenia, a Detekcja emisji jest wybierana przy szczytowej długości fali (lub innych długościach fal wybranych przez obserwatora) krzywej emisji. Wybór długości fal wzbudzenia i długości fal emisji jest kontrolowany przez odpowiednie filtry. Przy określaniu reakcji spektralnej układu optycznego wymagane są korekty techniczne uwzględniające takie czynniki, jak Transmisja Szkła i zmienne czułości detektora dla różnych długości fal.

typowy schemat widmowy absorpcji i emisji fluorochromu przedstawiono na fig. 2. Należy zauważyć, że krzywe natężenia fluorescencji dla Absorpcji (zwykle podobne do krzywej wzbudzenia dla czystych związków) i emisji dla tego typowego fluorochromu są nieco podobne w kształcie. Zmiana długości fali pomiędzy wzbudzeniem a emisją jest znana od połowy XIX wieku (prawo Stokesa). Należy również zauważyć, że krzywe wzbudzenia i emisji nakładają się nieco na górnym końcu wzbudzenia i na dolnych długościach fal krzywej emisji.

kostki filtrów fluorescencyjnych

Odkryj, w jaki sposób zmiany w obszarze długości fali pasma wzbudzenia i filtrach barierowych umożliwiają określone pasmo długości fal do oświetlania próbki, a następnie przechodzą do detektora, podczas gdy wszystkie inne są wykluczone.

separację długości fal wzbudzenia i emisji uzyskuje się poprzez właściwy dobór filtrów do blokowania lub przepuszczania określonych długości fal widma, jak przedstawiono na rysunku 3. Konstrukcja oświetlaczy fluorescencyjnych opiera się na kontroli światła wzbudzającego i światła emisyjnego poprzez łatwo wymienne wkłady filtracyjne do ścieżki światła w drodze do próbki, a następnie emanujące z próbki. Ważne jest, ze względu na niską intensywność emisji, aby Źródło światła wybrane do wzbudzenia miało wystarczającą jasność, aby można było zmaksymalizować stosunkowo słabe światło emisyjne oraz aby wybrano fluorochromy o zadowalającej absorpcji i wydajności.

efektywność, z jaką fluorochrom pochłania światło wzbudzenia, jest znana jako współczynnik ekstynkcji. Im większy współczynnik ekstynkcji, tym większa możliwość absorpcji światła w danym obszarze długości fali (warunek wstępny emisji fluorescencji). Wydajność emitowanego światła jest określana jako wydajność kwantowa, stosunek liczby wyemitowanych kwantów („pakietów” energii) do liczby pochłoniętych kwantów (Zwykle wydajność wynosi od 0,1 do 0,9). Plony kwantowe poniżej 1 są wynikiem utraty energii przez szlaki nieradiacyjne (takie jak ciepło lub reakcja fotochemiczna), a nie szlak ponownej radiacji fluorescencji. Poniżej w tabeli 1 przedstawiono ilości fluorescencji kwantowej dla grupy wybranych fluorochromów. Zauważ, że niektóre plony kwantowe wydają się trywialne (benzen), podczas gdy inne są bardzo wydajne (fluoresceina i Rodamina-B).

związek rozpuszczalnik wzbudzenie
długość fali
(nm)
emisja
długość fali
(nm)
wydajność kwantowa
Acridine Orange Etanol 493 535 0.46
benzen Etanol 248 300-350 0.04
Chlorofil-A Etanol 440 685 0.23
Eozyną Woda 521 544 0.16
Fluoresceiny Woda 437 515 0.92
Родамин-B Etanol 555 627 0.97
Tabela 1

Współczynnik ekstynkcji, wydajność kwantowa, średnia intensywność światła Źródła światła i żywotność fluorescencji są ważnymi czynnikami przyczyniającymi się do intensywności i użyteczności emisji fluorescencji. Ponadto zlokalizowane środowisko otaczające fluorochrom odgrywa kluczową rolę w określaniu właściwości emisji fluorescencji. Zmienne takie jak lepkość rozpuszczalnika, stężenia jonowe, pH i hydrofobowość w środowisku mogą mieć głęboki wpływ zarówno na intensywność fluorescencji, jak i na żywotność stanu wzbudzonego.

molekularne Wyjaśnienie fluorescencji

aktywność fluorescencji jest czasami przedstawiana schematycznie, jak pokazano na fig. Przed wzbudzeniem konfiguracja elektroniczna cząsteczki jest opisana jako znajdująca się w stanie podstawowym. Po wchłonięciu fotonu wzbudzającego światło, zwykle o krótkich długościach fal, elektrony mogą zostać podniesione do wyższej energii i wibracyjnego stanu wzbudzonego, procesu, który może zająć tylko kwadrylionową sekundy (okres czasu powszechnie określany jako femtosekunda, 10E-15 sekund).

w fluorescencji, w odstępie około trylionowej sekundy (pikosekunda lub 10E-12 sekund), wzbudzone elektrony mogą stracić pewną energię wibracyjną do otaczającego środowiska i powrócić do tego, co nazywa się najniższym wzbudzonym stanem singletowym. Z najniższego wzbudzonego stanu singletowego elektrony są następnie w stanie” zrelaksować się ” z powrotem do stanu podstawowego przy jednoczesnej emisji światła fluorescencyjnego, jak pokazano na rysunku 4(a). Emitowane światło ma zawsze dłuższą długość fali niż światło wzbudzenia (prawo Stokesa) i trwa tak długo, jak oświetlenie wzbudzenia kąpie próbkę fluorescencyjną. Jeśli ekscytujące promieniowanie zostanie zatrzymane, fluorescencja ustaje.

schemat energetyczny Jablonskiego

zbadaj, jak elektron pochłania energię i przekracza do wyższego stanu energetycznego zgodnie z diagramem poziomu energetycznego Jablonskiego. Gdy elektron jest w stanie wzbudzonym, powoli rozluźnia się poprzez efekty wibracyjne, a następnie może powrócić do stanu podstawowego, emitując Foton (fluorescencję).

czasami wzbudzone elektrony, zamiast relaksować się do najniższego stanu singletowego poprzez oddziaływania wibracyjne, dokonują zabronionego przejścia do stanu wyjściowego trypletu, a następnie do stanu podstawowego w procesie, w którym emisja promieniowania może być znacznie opóźniona-do kilku sekund lub więcej. Zjawisko to jest charakterystyczne dla fosforescencji, jak pokazano na fig. W niektórych przypadkach wzbudzone elektrony mogą przejść ze stanu trypletowego z powrotem do najniższego wzbudzonego stanu singletowego, a następnie powrócić do stanu podstawowego, emitując następnie światło fluorescencyjne. Działanie to trwa nieco dłużej (około mikrosekundy lub dwóch) niż zwykła fluorescencja i nazywa się fluorescencją opóźnioną (Rysunek 4 (c)). W innych okolicznościach (na przykład fotoczyszczenie lub obecność soli metali ciężkich lub innych chemikaliów) emitowane światło może zostać znacznie zmniejszone lub całkowicie zatrzymane, jak opisano poniżej.

blaknięcie lub Photobleaching

istnieją szczególne warunki, które mogą wpływać na ponowne promieniowanie światła przez wzbudzony fluorofor, a tym samym zmniejszać intensywność fluorescencji. To zmniejszenie intensywności emisji jest na ogół nazywane blaknięciem lub fotoblaknięciem. Niektórzy autorzy dalej dzielą blaknięcie na hartowanie i wybielanie. Wybielanie jest nieodwracalnym rozkładem cząsteczek fluorescencyjnych ze względu na natężenie światła w obecności tlenu cząsteczkowego. Hartowanie powoduje również zmniejszenie intensywności fluorescencji i często jest spowodowane czynnikami utleniającymi lub obecnością soli metali ciężkich lub związków halogenowych.

często hartowanie wynika z transferu energii do innych cząsteczek akceptora fizycznie blisko wzbudzonych fluoroforów, zjawiska znanego jako transfer energii rezonansowej. To szczególne zjawisko stało się podstawą nowszej techniki pomiaru odległości znacznie poniżej rozdzielczości bocznej mikroskopu świetlnego.

występowanie wybielania doprowadziło do techniki znanej jako FRAP lub odzyskiwanie fluorescencji po fotoblakowaniu. FRAP opiera się na wybielaniu przez krótkie wybuchy laserowe i późniejszej obserwacji odzyskiwania fluorescencji spowodowanej dyfuzją fluoroforów do bielonego obszaru.

właściwości popularnych odczynników przeciwzapalnych
odczynnik Przeciwfadowy
p-fenylen-
diamina
najskuteczniejszy odczynnik dla FITC. Skuteczny również dla Rodaminy. Należy dostosować do 0,1% p-fenylenodiaminy w glicerolu / PBS. Odczynnik czernieje pod wpływem ekspozycji na światło, dlatego powinien być przechowywany w ciemnym miejscu. Kontakt ze skórą jest niezwykle niebezpieczny.
DABCO
(1,4-diazabi-
cyklo-2,2,2 –
Oktan)
wysoce skuteczny dla FITC. Chociaż jego działanie jest nieco niższe niż P-fenylenodiamina, jest bardziej odporna na światło i charakteryzuje się wyższym poziomem bezpieczeństwa.
N-propylgallan najskuteczniejszy odczynnik dla Rodaminy, również skuteczny dla FITC. Należy dostosować do stosowania 1% propylogallanu w glicerolu/PBS.
2-merkapto –
etyloamina
używana do obserwacji próbek chromosomów i DNA zabarwionych jodkiem propidium, pomarańczą akrydynową lub Chromomysyną A3. Należy dostosować do 0,1 mM 2-merkaptotheylamine w Tris-EDTA
Tabela 2

aby zmniejszyć stopień blaknięcia w niektórych próbkach, może być wskazane użycie neutralnego filtra gęstości w ścieżce światła, zanim oświetlenie dotrze do filtra wzbudzenia, zmniejszając w ten sposób natężenie światła wzbudzenia. W innych przypadkach efekty blaknięcia mogą być zmniejszone poprzez zmianę pH podłoża montażowego lub zastosowanie środków zapobiegających wybielaniu (kilka ważniejszych środków wymieniono w tabeli 2). W przypadku obrazowania cyfrowego, fotomikrografii lub po prostu obserwacji wizualnej, szybka zmiana pola widzenia może również uniknąć efektów blaknięcia.

Autorzy

Mortimer Abramowitz – Olympus America, Inc., Two Corporate Center Drive., Melville, Nowy Jork, 11747.

Michael W. Davidson-National High Magnetic Field Laboratory, 1800 East Paul Dirac Dr., Florida State University, Tallahassee, Floryda, 32310.

Dodaj komentarz

Twój adres e-mail nie zostanie opublikowany.