por causa de seu romance configurações de electrónica, fluorocromos tem única e característica espectros de absorção (geralmente semelhantes aos de excitação) e a emissão. Estes espectros de absorção e emissão mostram intensidade relativa de fluorescência, com a intensidade relativa representada classicamente no eixo vertical versus comprimento de onda no eixo horizontal. Para um dado fluorocromo, os fabricantes indicam o comprimento de onda para o pico de intensidade de excitação da iluminação e o comprimento de onda para o pico de intensidade de emissão de fluorescência. É importante entender a origem dos grafos e curvas que exibem os espectros de excitação e emissão para um dado fluorocromo.

a fim de determinar o espectro de emissão de um fluorocromo particular, o comprimento de onda de absorção máxima (geralmente o mesmo que o máximo de excitação) é determinado e o fluorocromo é animado nesse comprimento de onda. O espectro de absorção de um fluorocromo típico é ilustrado na Figura 1 (a), em que a intensidade relativa de absorção é representada em função do comprimento de onda medido. Um monocromador (um dispositivo que permite que bandas estreitas de comprimentos de onda de luz passem) é então usado para escanear a intensidade de emissão de fluorescência ao longo de toda a série de comprimentos de onda de emissão. A intensidade relativa da fluorescência é medida nos vários comprimentos de onda para traçar o espectro de emissão, como ilustrado na Figura 1(b). O espectro de excitação de um dado fluorocromo é determinado de forma semelhante através da monitorização da emissão de fluorescência no comprimento de onda de intensidade máxima, enquanto o fluoróforo é excitado através de um grupo de comprimentos de onda consecutivos. Escolhe-se o máximo de emissão e só se permite que a luz de emissão no comprimento de onda em causa passe para o detector. A excitação é induzida (geralmente por meio de um monocromador) em vários comprimentos de onda de excitação e a intensidade da fluorescência emitida é medida em função do comprimento de onda. O resultado é um grafo ou curva (ilustrado na Figura 1 (a)), que retrata a intensidade de fluorescência relativa produzida por excitação sobre o espectro de comprimentos de onda de excitação.

espectros de filtro de fluorescência

Explore as regiões sobrepostas de perfis espectrais de fluorescência, emissão e filtro dicromático e como as alterações nas características de transmissão determinam a largura de banda dos comprimentos de onda passados através de várias combinações de filtros.

várias observações podem ser feitas a partir de um típico conjunto de excitação e emissão de curvas ou espectros. Há geralmente uma sobreposição entre a extremidade de comprimento de onda mais alta do espectro de excitação e a extremidade de comprimento de onda mais baixa do espectro de emissão. Esta sobreposição das intensidades de excitação e de emissão e dos comprimentos de onda [ilustrados na Figura 1 (C)] deve ser eliminada, em microscopia de fluorescência, através da selecção adequada para um filtro de excitação, um beamsplitter dicromático(em fluorescência luminosa reflectida) e um filtro de barreira ou de emissão. Caso contrário, a luz de excitação muito mais brilhante sobrecarrega a luz de fluorescência emitida mais fraca e diminui significativamente o contraste da amostra.

quando os electrões vão do estado excitado para o estado do solo (ver a secção abaixo intitulada explicação Molecular), há uma perda de energia vibracional. Como resultado, o espectro de emissão é deslocado para comprimentos de onda mais longos do que o espectro de excitação (comprimento de onda varia inversamente à energia de radiação). Este fenômeno é conhecido como Stokes Law ou Stokes shift. Quanto maior a mudança de Stokes, mais fácil é separar a luz de excitação da luz de emissão. O pico de intensidade de emissão é geralmente menor do que o pico de excitação, e a curva de emissão é muitas vezes uma imagem espelhada da curva de excitação, mas deslocada para comprimentos de onda mais longos. A fim de alcançar a intensidade máxima de fluorescência, o fluorocromo é geralmente animado no comprimento de onda no pico da curva de excitação, e a detecção de emissões é selecionada no comprimento de onda máximo (ou outros comprimentos de onda escolhidos pelo observador) da curva de emissão. As seleções de comprimentos de onda de excitação e comprimentos de onda de emissão são controlados por filtros apropriados. Na determinação da resposta espectral de um sistema óptico, são necessárias correcções técnicas para ter em conta factores como a transmissão em vidro e as variáveis de sensibilidade ao detector para diferentes comprimentos de onda.

um diagrama espectral típico de absorção e emissão de fluorocromo é ilustrado na Figura 2. Note que as curvas de intensidade de fluorescência para absorção (geralmente semelhantes à curva de excitação para compostos puros) e emissão para este fluorocromo típico são um pouco semelhantes em forma. A mudança de comprimento de onda entre excitação e emissão é conhecida desde meados do século XIX (Lei Stokes). Note também que as curvas de excitação e emissão se sobrepõem um pouco na extremidade superior da excitação e os comprimentos de onda inferiores da curva de emissão.

cubos com Filtro De Fluorescência

descubra como as variações na região do comprimento de onda da banda dos filtros de excitação e barreira permitem que uma banda específica de comprimentos de onda ilumine a amostra e, em seguida, passe para o detector, enquanto todos os outros estão excluídos.

a separação dos comprimentos de onda de excitação e de emissão é conseguida pela seleção adequada de filtros para bloquear ou passar comprimentos de onda específicos do espectro, tal como apresentado na Figura 3. A concepção dos iluminadores de fluorescência baseia-se no controlo da luz de excitação e da luz de emissão através de inserções de filtros facilmente modificáveis no caminho da luz no caminho para o provete e, em seguida, emanando do provete. É importante, tendo em conta as intensidades de emissão baixas, que a fonte de luz escolhida para a excitação seja de brilho suficiente para que a luz de emissão relativamente fraca possa ser maximizada, e que os fluorocromos de absorção satisfatória e rendimento sejam escolhidos.

a eficiência com que o fluorocromo absorve a luz de excitação é conhecida como o coeficiente de extinção. Quanto maior o coeficiente de extinção, maior a possibilidade de absorção de luz em uma determinada região de comprimento de onda (um pré-requisito para a emissão de fluorescência subsequente). O Rendimento da luz emitida é referido como o rendimento quântico, a razão do número de quanta (“pacotes” de energia) emitido em comparação com o número de quanta absorvido (geralmente o rendimento é entre 0,1 e 0,9). Os rendimentos quânticos abaixo de 1 são o resultado da perda de energia através de vias não radiativas (como calor ou uma reação fotoquímica) ao invés da via re-radiativa de fluorescência. Listados abaixo na Tabela 1 são os valores quânticos de fluorescência para um grupo de fluorocromos selecionados. Note que alguns rendimentos quânticos parecem triviais (benzeno), enquanto outros são muito eficientes (fluoresceína e rodamina-B).

Fluorocromo Quântica de Fluorescência Rendimentos
Composto Solvente Excitação
o comprimento de Onda
(nm)
Emissão
o comprimento de Onda
(nm)
Rendimento Quântico
Acridina Laranja Etanol 493 535 0.46
Benzeno Etanol 248 300-350 0.04
A Clorofila-A Etanol 440 685 0.23
Eosina Água 521 544 0.16
Fluoresceína Água 437 515 0.92
Rodamina-B Etanol 555 627 0.97
Quadro 1

coeficiente de Extinção, rendimento quântico, intensidade luminosa média da fonte de luz, e vida de fluorescência são fatores importantes que contribuem para a intensidade e utilidade da emissão de fluorescência. Além disso, o ambiente localizado em torno do fluorocromo desempenha um papel fundamental na determinação das características da emissão de fluorescência. Variáveis como viscosidade do solvente, concentrações iônicas, pH e hidrofobicidade no ambiente podem ter efeitos profundos tanto na intensidade de fluorescência quanto na vida útil do estado excitado.

a explicação Molecular da fluorescência

a actividade de fluorescência é por vezes representada diagramaticamente como indicado na Figura 4(a) (designada por Diagrama de energia de Jablonski). Antes da excitação, a configuração eletrônica da molécula é descrita como estando no estado do solo. Ao absorver um fóton de luz de excitação, geralmente de comprimentos de onda curtos, os elétrons podem ser elevados a uma energia mais elevada e um estado vibracional excitado, um processo que pode levar apenas um quadrilionésimo de segundo (um período de tempo comumente referido como um femtosegundo, 10E-15 segundos).

Na fluorescência, durante um intervalo de cerca de um trilionésimo de segundo (um picosecond ou 10E-12 segundos), o animado elétrons podem perder alguma energia vibracional para o ambiente circundante e voltar para o que é chamado o menor excitado singlete estado. A partir do mais baixo estado excitado, os elétrons são então capazes de “relaxar” de volta ao estado do solo com emissão simultânea de luz fluorescente, como ilustrado na Figura 4(a). A luz emitida é sempre de comprimento de onda mais longo do que a luz de excitação (Lei Stokes) e continua enquanto a iluminação de excitação banhar o espécime fluorescente. Se a radiação emocionante é interrompida, a fluorescência cessa.

Diagrama de energia de Jablonski

Explore como um electrão absorve energia e transcende para um estado de energia superior de acordo com um diagrama de nível de energia de Jablonski. Uma vez que um elétron está no estado excitado, ele lentamente relaxa através de efeitos Vibracionais e pode então cair de volta para o estado do solo emitindo um fóton (fluorescência).

Ocasionalmente, o animado elétrons, em vez de relaxar para o menor estado singlete através vibracional medicamentosas, fazer uma proibido de transição para o trio saiu do estado e, em seguida, para o estado fundamental, em um processo onde a emissão de radiação pode ser consideravelmente atrasada até vários segundos ou mais. Este fenômeno é característico da fosforescência, como mostrado na Figura 4(b). In some instances, the excited electrons may go from the triplet state back to the lowest excited singlet state and then return to the ground state, subsequently emitting fluorescent light. Esta acção demora um pouco mais (cerca de um microssegundo ou dois) do que a fluorescência habitual e é chamada fluorescência retardada (Figura 4(C)). Em outras circunstâncias (por exemplo, fotobleaching ou a presença de sais de metais pesados ou de outros produtos químicos), a luz emitida pode ser significativamente reduzida ou interrompida completamente, como discutido abaixo.

desbotamento ou Fotobleaching

existem condições específicas que podem afectar a re-radiação da luz por um fluoróforo excitado, reduzindo assim a intensidade de fluorescência. Esta redução da intensidade de emissão é geralmente chamada de desbotamento ou fotobleaching. Alguns autores ainda subdividem-se em desbaste e branqueamento. O branqueamento é a decomposição irreversível das moléculas fluorescentes devido à intensidade da luz na presença de oxigénio molecular. A extinção também resulta em intensidade de fluorescência reduzida e é frequentemente provocada como resultado de agentes oxidantes ou da presença de sais de metais pesados ou de compostos halogenados.

muitas vezes, a extinção resulta da transferência de energia para outras moléculas aceitadoras fisicamente próximas dos fluoróforos excitados, um fenômeno conhecido como transferência de energia de ressonância. Este fenômeno particular tornou-se a base para uma nova técnica de medição de distâncias muito abaixo da resolução lateral do microscópio de luz.

a ocorrência de descoloração levou a uma técnica conhecida como FRAP, ou recuperação de fluorescência após fotoblefação. O FRAP baseia-se na descoloração por pequenas explosões laser e na observação subsequente da recuperação de fluorescência causada pela difusão de fluoróforos na área branqueada.

Propriedades do Popular Antifade Reagentes
Antifade Reagente
p-fenileno-
diamina
mais eficaz de reagentes para FITC. Também é eficaz para a rodamina. Deve ser ajustado para 0, 1% de P-fenilenodiamina em glicerol/PBS para utilização. O reagente fica negro quando sujeito a exposição à luz, pelo que deve ser armazenado num local escuro. O contacto com a pele é extremamente perigoso.
DABCO
(1,4-diazabi-
ciclo-2,2,2-
octano)
altamente eficaz para a FITC. Embora o seu efeito seja ligeiramente inferior à P-fenilenodiamina, é mais resistente à luz e apresenta um maior nível de segurança.
n-propilgalato o reagente mais eficaz para a rodamina, também eficaz para FITC. Deve ser ajustado para 1% de propilgalato em glicerol/PBS para utilização.
2-mercapto-
etilamina
utilizado para observar espécimes de cromossomas e ADN manchados com iodeto de propídio, laranja acridina ou Cromomysina A3. Deve ser ajustado para 0,1 mM 2-mercaptotheylamine em Tris-EDTA
Tabela 2

Para reduzir o grau de atenuação em algumas amostras, pode ser aconselhável a utilização de um filtro de densidade neutra no caminho da luz antes que a iluminação atinge o filtro da excitação, diminuindo a excitação de intensidade de luz. Noutros casos, os efeitos de atenuação podem ser reduzidos alterando o pH do meio de montagem ou utilizando agentes anti-branqueamento (vários dos agentes mais importantes estão listados no quadro 2). Para imagens digitais, fotomicrografia, ou simplesmente observação visual, a rápida mudança do campo de visão também pode evitar efeitos de desvanecimento.

Autores Contribuintes

Mortimer Abramowitz-Olympus America, Inc., Dois Centros Corporativos., Melville, New York, 11747.Michael W. Davidson-National High Magnetic Field Laboratory, 1800 East Paul Dirac Dr., The Florida State University, Tallahassee, Florida, 32310.

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