datorită configurațiilor electronice noi, fluorocromii au spectre unice și caracteristice pentru absorbție (de obicei similare excitației) și emisie. Aceste spectre de absorbție și emisie arată intensitatea relativă a fluorescenței, intensitatea relativă fiind reprezentată clasic pe axa verticală față de lungimea de undă pe axa orizontală. Pentru un fluorocrom dat, producătorii indică lungimea de undă pentru vârful intensității excitației de iluminare și lungimea de undă pentru vârful intensității emisiei de fluorescență. Este important să înțelegem originea graficelor și curbelor care afișează spectrele de excitație și emisie pentru un fluorocrom dat.

pentru a determina spectrul de emisie al unui anumit fluorocrom, se determină lungimea de undă a absorbției maxime (de obicei aceeași cu maximul de excitație) și fluorocromul este excitat la acea lungime de undă. Spectrul de absorbție al unui fluorocrom tipic este ilustrat în Figura 1(A), unde intensitatea relativă a absorbției este reprezentată grafic pe lungimea de undă măsurată. Un monocromator (un dispozitiv care permite trecerea benzilor înguste de lungimi de undă luminoase) este apoi utilizat pentru a scana intensitatea emisiei de fluorescență pe întreaga serie de lungimi de undă de emisie. Intensitatea relativă a fluorescenței este măsurată la diferite lungimi de undă pentru a trasa spectrul de emisie, așa cum este ilustrat în Figura 1(b). Spectrul de excitație al unui fluorocrom dat este determinat în mod similar prin monitorizarea emisiei de fluorescență la lungimea de undă a intensității maxime în timp ce fluoroforul este excitat printr-un grup lungimi de undă consecutive. Se alege maximul de emisie și numai lumina de emisie la acea lungime de undă este permisă să treacă la detector. Excitația este indusă (de obicei prin intermediul unui monocromator) la diferite lungimi de undă de excitație și intensitatea fluorescenței emise este măsurată în funcție de lungimea de undă. Rezultatul este un grafic sau o curbă (ilustrată în Figura 1(A)), care descrie intensitatea relativă a fluorescenței produsă de excitație pe spectrul lungimilor de undă de excitație.

spectrele filtrului de fluorescență

explorați regiunile de suprapunere ale profilurilor spectrale de excitație fluorescentă, emisie și filtru dicromatic și modul în care modificările caracteristicilor de transmisie determină lățimea de bandă a lungimilor de undă trecute prin diferite combinații de filtre.

mai multe observații pot fi făcute dintr-un set tipic de excitație și emisie de curbe sau Spectre. De obicei, există o suprapunere între capătul lungimii de undă mai mari a spectrului de excitație și capătul lungimii de undă mai mici a spectrului de emisie. Această suprapunere a intensităților de excitație și de emisie și a lungimilor de undă [ilustrată în Figura 1 litera (c)] trebuie eliminată, în microscopia fluorescentă, prin selectarea adecvată pentru un filtru de excitație, un beamsplitter dicromatic(în fluorescența luminii reflectate) și un filtru de barieră sau de emisie. În caz contrar, lumina de excitație mult mai strălucitoare copleșește lumina fluorescentă emisă mai slabă și diminuează semnificativ contrastul specimenului.

când electronii trec de la starea excitată la starea de bază (vezi secțiunea de mai jos intitulată explicație moleculară), există o pierdere de energie vibrațională. Ca urmare, spectrul de emisie este deplasat la lungimi de undă mai lungi decât spectrul de excitație (lungimea de undă variază invers la energia radiației). Acest fenomen este cunoscut sub numele de Stokes Law sau Stokes shift. Cu cât este mai mare schimbarea Stokes, cu atât este mai ușor să separați lumina de excitație de lumina de emisie. Vârful intensității emisiilor este de obicei mai mic decât vârful de excitație, iar curba de emisie este adesea o imagine în oglindă a curbei de excitație, dar deplasată la lungimi de undă mai lungi. Pentru a atinge intensitatea maximă a fluorescenței, fluorocromul este de obicei excitat la lungimea de undă la vârful curbei de excitație, iar detectarea emisiilor este selectată la lungimea de undă de vârf (sau alte lungimi de undă alese de observator) a curbei de emisie. Selecțiile lungimilor de undă de excitație și lungimile de undă de emisie sunt controlate de filtre adecvate. La determinarea răspunsului spectral al unui sistem optic, sunt necesare corecții tehnice pentru a lua în considerare factori precum transmisia sticlei și variabilele de sensibilitate ale detectorului pentru diferite lungimi de undă.

o diagramă spectrală tipică de absorbție-emisie a fluorocromului este ilustrată în Figura 2. Rețineți că curbele intensității fluorescenței pentru absorbție (de obicei similare cu curba de excitație pentru compușii puri) și emisia pentru acest fluorocrom tipic au o formă oarecum similară. Schimbarea lungimii de undă între excitație și emisie este cunoscută de la mijlocul secolului al XIX-lea (Legea Stokes). De asemenea, rețineți că curbele de excitație și emisie se suprapun oarecum la capătul superior al excitației și lungimile de undă inferioare ale curbei de emisie.

cuburi de filtru fluorescent

Descoperiți cum variațiile din regiunea lungimii de undă a benzii de excitație și filtrele de barieră permit unei anumite benzi de lungimi de undă să lumineze specimenul și apoi să treacă la detector în timp ce toate celelalte sunt excluse.

separarea lungimilor de undă de excitație și emisie se realizează prin selectarea corectă a filtrelor pentru a bloca sau a trece lungimi de undă specifice ale spectrului așa cum este prezentat în Figura 3. Proiectarea iluminatoarelor de fluorescență se bazează pe controlul luminii de excitație și a luminii de emisie prin inserții de filtru ușor schimbabile în calea luminii pe drumul spre specimen și apoi emanate de specimen. Este important, având în vedere intensitățile scăzute ale emisiilor, ca sursa de lumină aleasă pentru excitație să aibă o luminozitate suficientă, astfel încât lumina de emisie relativ slabă să poată fi maximizată și să fie aleși fluorocromi de absorbție și randament satisfăcătoare.

eficiența cu care fluorocromul absoarbe lumina de excitație este cunoscută sub numele de coeficientul de extincție. Cu cât este mai mare coeficientul de extincție, cu atât este mai mare posibilitatea absorbției luminii într-o anumită regiune a lungimii de undă (o condiție prealabilă pentru emisia de fluorescență care urmează). Randamentul luminii emise este denumit randamentul cuantic, raportul dintre numărul de cuante („pachete” de energie) emise în comparație cu numărul de cuante absorbite (de obicei randamentul este cuprins între 0,1 și 0,9). Randamentele cuantice sub 1 sunt rezultatul pierderii de energie prin căi non-radiative (cum ar fi căldura sau o reacție fotochimică), mai degrabă decât calea re-radiativă a fluorescenței. Enumerate mai jos în tabelul 1 sunt randamentele cuantice de fluorescență pentru un grup de fluorocromi selectați. Observați că unele randamente cuantice par banale (benzen), în timp ce altele sunt foarte eficiente (fluoresceină și Rodamină-B).

randamente cuantice de fluorescență Fluorocromă
compus Solvent excitație
lungime de undă
(nm)
emisie
lungime de undă
(nm)
randament cuantic
acridină portocaliu etanol 493 535 0.46
benzen etanol 248 300-350 0.04
Clorofilă-A Etanol 440 685 0.23
Eozină Apă 521 544 0.16
Fluoresceină Apă 437 515 0.92
Rodamină-B Etanol 555 627 0.97
Tabel 1

coeficientul de extincție, randamentul cuantic, intensitatea luminoasă medie a sursei de lumină și durata de viață a fluorescenței sunt factori importanți care contribuie la intensitatea și utilitatea emisiei de fluorescență. În plus, mediul localizat din jurul fluorocromului joacă un rol primordial în determinarea caracteristicilor emisiei de fluorescență. Variabile precum vâscozitatea solventului, concentrațiile ionice, pH-ul și hidrofobicitatea în mediu pot avea efecte profunde atât asupra intensității fluorescenței, cât și asupra duratei de viață a stării excitate.

explicația moleculară a fluorescenței

activitatea fluorescenței este uneori descrisă schematic așa cum se arată în Figura 4(a) (denumită diagrama energiei Jablonski). Înainte de excitație, configurația electronică a moleculei este descrisă ca fiind în starea de bază. La absorbția unui foton de lumină de excitație, de obicei cu lungimi de undă scurte, electronii pot fi ridicați la o stare excitată de energie și vibrație mai mare, un proces care poate dura doar o cvadrilionime de secundă (o perioadă de timp denumită în mod obișnuit femtosecundă, 10E-15 secunde).

în fluorescență, într-un interval de aproximativ o miliardime de secundă (o picosecundă sau 10E-12 secunde), electronii excitați pot pierde o anumită energie vibrațională în mediul înconjurător și pot reveni la ceea ce se numește cea mai mică stare de singlet excitat. Din cea mai mică stare de singlet excitat, electronii sunt apoi capabili să se „relaxeze” înapoi la starea de bază cu emisie simultană de lumină fluorescentă așa cum este ilustrat în Figura 4(a). Lumina emisă are întotdeauna o lungime de undă mai mare decât lumina de excitație (Legea Stokes) și continuă atât timp cât iluminarea de excitație scaldă specimenul fluorescent. Dacă radiația excitantă este oprită, fluorescența încetează.

diagrama energiei Jablonski

explorați modul în care un electron absoarbe energia și transcende la o stare de energie mai mare conform unei diagrame La nivel de energie Jablonski. Odată ce un electron se află în starea excitată, acesta se relaxează încet prin efecte vibraționale și apoi poate scădea înapoi la starea de bază prin emiterea unui foton (fluorescență).

Ocazional, electronii excitați, în loc să se relaxeze la cea mai joasă stare singlet prin interacțiuni vibraționale, fac o tranziție interzisă la starea tripletă ieșită și apoi la starea de bază într-un proces în care emisia de radiații poate fi întârziată considerabil-până la câteva secunde sau mai mult. Acest fenomen este caracteristic fosforescenței, așa cum se arată în Figura 4(b). În unele cazuri, electronii excitați pot trece de la starea tripletă înapoi la cea mai mică stare de singlet excitat și apoi se pot întoarce la starea de bază, emițând ulterior lumină fluorescentă. Această acțiune durează puțin mai mult (aproximativ o microsecundă sau două) decât fluorescența obișnuită și se numește fluorescență întârziată (Figura 4(c)). În alte circumstanțe (de exemplu, fotobleaching sau prezența sărurilor metalelor grele sau a altor substanțe chimice), lumina emisă poate fi redusă semnificativ sau oprită cu totul, după cum se discută mai jos.

decolorare sau Fotobleaching

există condiții specifice care pot afecta re-radiația luminii de către un fluorofor excitat și, astfel, pot reduce intensitatea fluorescenței. Această reducere a intensității emisiilor se numește în general decolorare sau fotobleaching. Unii autori subdivizează în continuare decolorarea în stingere și albire. Albirea este descompunerea ireversibilă a moleculelor fluorescente din cauza intensității luminii în prezența oxigenului molecular. Stingerea are ca rezultat, de asemenea, o intensitate redusă a fluorescenței și se produce frecvent ca urmare a agenților oxidanți sau a prezenței sărurilor metalelor grele sau a compușilor cu halogen.

deseori, stingerea rezultă din transferul de energie către alte molecule acceptoare apropiate fizic de fluoroforii excitați, fenomen cunoscut sub numele de transfer de energie prin rezonanță. Acest fenomen particular a devenit baza pentru o tehnică mai nouă de măsurare a distanțelor mult sub rezoluția laterală a microscopului luminos.

apariția albirii a dus la o tehnică cunoscută sub numele de FRAP sau recuperarea fluorescenței după fotobleaching. FRAP se bazează pe albirea prin explozii scurte cu laser și observarea ulterioară a recuperării fluorescenței cauzate de difuzia fluoroforilor în zona albită.

proprietățile reactivilor Antifade populari
Reactiv Antifade
p-fenilen-
diamină
cel mai eficient Reactiv pentru FITC. De asemenea, eficient pentru Rodamină. Trebuie ajustat la 0,1% P-fenilendiamină în glicerol/PBS pentru utilizare. Reactivul se înnegrește atunci când este expus la lumină, deci trebuie depozitat într-un loc întunecat. Contactul cu pielea este extrem de periculos.
DABCO
(1,4-diazabi-
ciclo-2,2,2-
octan)
foarte eficient pentru FITC. Deși efectul său este puțin mai mic decât P-fenilendiamina, este mai rezistent la lumină și prezintă un nivel mai ridicat de siguranță.
n-propilgalat cel mai eficient Reactiv pentru Rodamină, eficient și pentru FITC. Trebuie ajustat la 1% propilgalat în glicerol / PBS pentru utilizare.
2-mercapto-
etilamină
utilizată pentru a observa specimene de cromozomi și ADN colorate cu iodură de propidiu, acridină portocalie sau Cromomizină A3. Trebuie ajustat la 0,1 mM 2-mercaptoteilamină în Tris-EDTA
Tabel 2

pentru a reduce gradul de decolorare în unele exemplare, poate fi recomandabil să se utilizeze un filtru de densitate neutră în calea luminii înainte ca iluminarea să ajungă la filtrul de excitație, diminuând astfel intensitatea luminii de excitație. În alte cazuri, efectele de decolorare pot fi reduse prin modificarea pH-ului mediului de montare sau prin utilizarea agenților antialbitori (câțiva dintre agenții mai importanți sunt enumerați în tabelul 2). Pentru imagistica digitală, fotomicrografie sau pur și simplu observație vizuală, schimbarea rapidă a câmpului vizual poate evita, de asemenea, efectele de estompare.

Autori Contributori

Mortimer Abramowitz – Olympus America, Inc., Două Unitate Centru Corporativ., Melville, New York, 11747.

Michael W. Davidson-Laboratorul Național De Câmp Magnetic Înalt, 1800 East Paul Dirac Dr., Universitatea De Stat Din Florida, Tallahassee, Florida, 32310.

Lasă un răspuns

Adresa ta de email nu va fi publicată.