på grund av deras nya elektroniska konfigurationer, fluorokromer har unika och karakteristiska spektra för absorption (vanligen liknar excitation) och emission. Dessa absorptions-och emissionsspektra visar relativ intensitet av fluorescens, med den relativa intensiteten klassiskt ritad på den vertikala axeln kontra våglängden på den horisontella axeln. För en given fluorokrom anger tillverkarna våglängden för toppen av belysningsexciteringsintensiteten och våglängden för toppen av fluorescensutsläppsintensiteten. Det är viktigt att förstå ursprunget för graferna och kurvorna som visar excitations-och emissionsspektra för en given fluorokrom.

för att bestämma emissionsspektrumet för ett visst fluorokrom bestäms våglängden för maximal absorption (vanligtvis samma som excitationsmaximumet) och fluorokromen exciteras vid den våglängden. Absorptionsspektrumet för ett typiskt fluorokrom illustreras i Figur 1(A) där den relativa absorptionsintensiteten ritas mot den uppmätta våglängden. En monokromator (en anordning som tillåter smala band av ljusvåglängder att passera) används sedan för att skanna fluorescensutsläppsintensiteten över hela serien av emissionsvåglängder. Fluorescensens relativa intensitet mäts vid de olika våglängderna för att plotta emissionsspektrumet, som illustreras i Figur 1(b). Excitationsspektrumet för en given fluorokrom bestäms på ett liknande sätt genom att övervaka fluorescensutsläpp vid våglängden för maximal intensitet medan fluorofor exciteras genom en grupp på varandra följande våglängder. Emissionsmängden väljs och endast emissionsljus vid den våglängden får passera till detektorn. Excitation induceras (vanligtvis med hjälp av en monokromator) vid olika exciteringsvåglängder och intensiteten hos den emitterade fluorescensen mäts som en funktion av våglängden. Resultatet är en graf eller kurva (illustrerad i Figur 1(a)), som visar den relativa fluorescensintensiteten som produceras genom excitation över spektrumet av exciteringsvåglängder.

Fluorescensfilterspektra

utforska överlappningsregionerna för fluorescensexcitering, emission och dikromatisk filterspektralprofiler och hur förändringar i överföringsegenskaperna bestämmer bandbredden för våglängder som passerar genom olika filterkombinationer.

Flera observationer kan göras från en typisk excitation och emission uppsättning kurvor eller spektra. Det finns vanligtvis en överlappning mellan den högre våglängdsänden av excitationsspektrumet och den nedre våglängdsänden av emissionsspektrumet. Denna överlappning av exciterings-och emissionsintensiteter och våglängder (illustrerad i Figur 1(c)) måste elimineras, i fluorescensmikroskopi, med hjälp av lämpligt val för ett exciteringsfilter, dikromatisk strålsplitter (i reflekterat ljus fluorescens) och barriär-eller emissionsfilter. Annars överväldigar det mycket ljusare excitationsljuset det svagare emitterade fluorescensljuset och minskar signifikant provkontrast.

när elektroner går från det upphetsade tillståndet till marktillståndet (se avsnittet nedan med titeln Molekylär förklaring), är det en förlust av vibrationsenergi. Som ett resultat flyttas emissionsspektrumet till längre våglängder än excitationsspektret (våglängden varierar omvänt till strålningsenergi). Detta fenomen är känt som Stokes Law eller Stokes shift. Ju större Stokes skiftar, desto lättare är det att separera excitationsljus från emissionsljus. Emissionsintensitetstoppen är vanligtvis lägre än excitationstoppen, och emissionskurvan är ofta en spegelbild av excitationskurvan, men flyttas till längre våglängder. För att uppnå maximal fluorescensintensitet exciteras fluorokromen vanligtvis vid våglängden vid toppen av excitationskurvan och emissionsdetektering väljs vid toppvåglängden (eller andra våglängder som valts av observatören) för emissionskurvan. Valen av exciteringsvåglängder och emissionsvåglängder styrs av lämpliga filter. Vid bestämning av spektralresponsen hos ett optiskt system krävs tekniska korrigeringar för att ta hänsyn till sådana faktorer som glasöverföring och detektorkänslighetsvariabler för olika våglängder.

ett typiskt fluorokromabsorptionsspektraldiagram illustreras i Figur 2. Observera att kurvorna för fluorescensintensitet för absorption (vanligtvis liknar excitationskurvan för rena föreningar) och utsläpp för denna typiska fluorokrom är något liknande i form. Våglängdsförskjutningen mellan excitation och emission har varit känd sedan mitten av artonhundratalet (Stokes Law). Observera också att exciterings-och emissionskurvorna överlappar något i den övre änden av excitationen och de nedre våglängderna för emissionskurvan.

Fluorescensfilterkuber

Upptäck hur variationer i bandpassvåglängdsområdet för exciterings-och barriärfilter tillåter ett specifikt band av våglängder att belysa provet och sedan passera till detektorn medan alla andra är uteslutna.

separationen av exciterings-och emissionsvåglängder uppnås genom korrekt val av filter för att blockera eller passera specifika våglängder i spektrumet som presenteras i Figur 3. Utformningen av fluorescensbelysning är baserad på kontroll av excitationsljus och emissionsljus genom lätt utbytbara filterinsättningar i ljusvägen på vägen mot provet och sedan härrör från provet. Med tanke på låga emissionsintensiteter är det viktigt att ljuskällan som valts för excitation har tillräcklig ljusstyrka så att det relativt svaga emissionsljuset kan maximeras och att fluorokromer med tillfredsställande absorption och utbyte väljs.

effektiviteten med vilken fluorokrom absorberar excitationsljuset kallas utrotningskoefficienten. Ju större utrotningskoefficient, desto större är möjligheten till ljusabsorption i en given våglängdsregion (en förutsättning för efterföljande fluorescensutsläpp). Utbytet av emitterat ljus kallas kvantutbytet, förhållandet mellan antalet kvanta (”paket” av energi) som emitteras jämfört med antalet absorberade kvanta (vanligtvis är utbytet mellan 0, 1 och 0, 9). Kvantutbyten under 1 är resultatet av förlust av energi genom icke-radiativa vägar (såsom värme eller en fotokemisk reaktion) snarare än den re-radiativa vägen för fluorescens. Nedan i Tabell 1 listas fluorescenskvantumutbyten för en grupp utvalda fluorokromer. Observera att vissa kvantutbyten verkar triviala (bensen) medan andra är mycket effektiva (Fluorescein och Rhodamin-B).

Fluorokrom fluorescens Kvantutbyten
förening lösningsmedel Excitation
våglängd
(nm)
Emission
våglängd
(nm)
Kvantutbyte
Akridin Orange etanol 493 535 0.46
bensen etanol 248 300-350 0.04
Klorofyll-A Etanol 440 685 0.23
Eosin Vatten 521 544 0.16
Fluorescein Vatten 437 515 0.92
Rhodamin-B Etanol 555 627 0.97
Tabell 1

Utrotningskoefficient, kvantutbyte, medelljusintensitet hos ljuskällan och fluorescenslängd är alla viktiga faktorer som bidrar till intensiteten och nyttan av fluorescensutsläpp. Dessutom spelar den lokaliserade miljön som omger fluorokrom en viktig roll för att bestämma egenskaperna hos fluorescensutsläpp. Variabler såsom lösningsmedelsviskositet, Joniska koncentrationer, pH och hydrofobicitet i miljön kan ha djupgående effekter på både fluorescensintensiteten och livslängden för det upphetsade tillståndet.

Molekylär förklaring av fluorescens

Fluorescensaktivitet avbildas ibland schematiskt som visas i Figur 4(A) (benämnt ett Jablonski-energidiagram). Före excitation beskrivs den elektroniska konfigurationen av molekylen som i marktillståndet. Vid absorption av en foton av excitationsljus, vanligtvis med korta våglängder, kan elektroner höjas till ett högre energi-och vibrationellt upphetsat tillstånd, en process som bara kan ta en kvadrilliondel av en sekund (en tidsperiod som vanligtvis kallas en femtosekund, 10E-15 sekunder).

i fluorescens, under ett intervall på ungefär en biljondels sekund (en pikosekund eller 10e-12 sekunder), kan de upphetsade elektronerna förlora viss vibrationsenergi till omgivningen och återgå till det som kallas det lägsta upphetsade singlet-tillståndet. Från det lägsta upphetsade singlet-tillståndet kan elektronerna sedan ”slappna av” tillbaka till marktillståndet med samtidig utsläpp av fluorescerande ljus som illustreras i Figur 4(A). Det utsända ljuset har alltid längre våglängd än exciteringsljuset (Stokes Law) och fortsätter så länge exciteringsbelysningen badar det fluorescerande provet. Om den spännande strålningen stoppas upphör fluorescensen.

Jablonski energidiagram

utforska hur en elektron absorberar energi och överskrider ett högre energitillstånd enligt ett Jablonski energinivådiagram. När en elektron är i exciterat tillstånd slappnar den långsamt av genom vibrationella effekter och kan sedan falla tillbaka till marktillståndet genom att avge en foton (fluorescens).

ibland gör de upphetsade elektronerna, i stället för att koppla av till det lägsta singlettillståndet genom vibrationella interaktioner, en förbjuden övergång till det avslutade tripletttillståndet och sedan till marktillståndet i en process där strålningsutsläppet kan fördröjas avsevärt-upp till flera sekunder eller mer. Detta fenomen är karakteristiskt för fosforescens, som visas i Figur 4(b). I vissa fall kan de upphetsade elektronerna gå från tripletttillståndet tillbaka till det lägsta upphetsade singlet-tillståndet och sedan återgå till marktillståndet och därefter avge fluorescerande ljus. Denna åtgärd tar lite längre tid (ungefär en mikrosekund eller två) än vanligt fluorescens och kallas fördröjd fluorescens(Figur 4 (c)). Under andra omständigheter (till exempel fotoblekning eller närvaron av salter av tungmetaller eller andra kemikalier) kan emitterat ljus minskas eller stoppas helt, vilket diskuteras nedan.

blekning eller fotoblekning

det finns specifika förhållanden som kan påverka återstrålningen av ljus av en upphetsad fluorofor och därmed minska fluorescensintensiteten. Denna minskning av utsläppsintensiteten kallas vanligtvis blekning eller fotoblekning. Vissa författare delar vidare blekning i släckning och blekning. Blekning är irreversibel sönderdelning av de fluorescerande molekylerna på grund av ljusintensitet i närvaro av molekylärt syre. Släckning resulterar också i minskad fluorescensintensitet och uppstår ofta som ett resultat av oxidationsmedel eller närvaron av salter av tungmetaller eller halogenföreningar.

ofta resulterar släckning från överföring av energi till andra acceptormolekyler fysiskt nära de upphetsade fluoroforerna, ett fenomen som kallas resonansenergiöverföring. Detta speciella fenomen har blivit grunden för en nyare teknik för att mäta avstånd långt under ljusmikroskopets laterala upplösning.

förekomsten av blekning har lett till en teknik som kallas FRAP eller fluorescensåtervinning efter fotoblekning. FRAP baseras på blekning genom korta laserbrott och efterföljande observation av återhämtningen av fluorescens orsakad av diffusion av fluoroforer i det blekta området.

egenskaper hos populära Antifade reagenser
Antifade reagens
p-fenylen –
diamin
det mest effektiva reagenset för FITC. Också effektiv för Rhodamin. Bör justeras till 0,1% p-fenylendiamin i glycerol / PBS för användning. Reagenset blir svart när det utsätts för ljus exponering så det bör förvaras på en mörk plats. Hudkontakt är extremt farligt.
DABCO
(1,4-diazabi-
cyklo-2,2,2-
oktan)
mycket effektiv för FITC. Även om dess effekt är något lägre än p-fenylendiamin, är den mer motståndskraftig mot ljus och har en högre säkerhetsnivå.
n-propylgallat det mest effektiva reagenset för Rhodamin, även effektivt för FITC. Bör justeras till 1% propylgallat i glycerol / PBS för användning.
2-merkapto –
etylamin
används för att observera kromosom-och DNA-prover färgade med propidiumjodid, akridinorange eller Kromomysin A3. Bör justeras till 0,1 mM 2-merkaptoteylamin i Tris-EDTA
Tabell 2

för att minska graden av blekning i vissa prover kan det vara tillrådligt att använda ett neutralt densitetsfilter i ljusvägen innan belysningen når exciteringsfiltret, vilket minskar exciteringsljusintensiteten. I andra fall kan blekningseffekterna minskas genom att pH-värdet på monteringsmediet ändras eller genom användning av anti-blekmedel (flera av de viktigaste agenterna anges i Tabell 2). För digital avbildning, fotomikrografi, eller helt enkelt visuell observation, snabbt ändra synfältet kan också undvika blekning effekter.

Bidragande Författare

Mortimer Abramowitz – Olympus America, Inc., Två Företag Center Drive., Melville, New York, 11747.

Michael W. Davidson-Nationellt Högmagnetiskt Fältlaboratorium, 1800 Öst Paul Dirac Dr., Florida State University, Tallahassee, Florida, 32310.

Lämna ett svar

Din e-postadress kommer inte publiceras.